Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención JSPS KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (No. 19K10397 a H.K. y No. 18K09862 a I.M.).

Todos los procedimientos y el cuidado de los animales se realizaron de acuerdo con las reglas y regulaciones de la Universidad de Tohoku.
1. Disección de calvaria de ratón dmp1-topacio recién nacido
<ol><li>Para este protocolo, use cachorros de 6 a 27 días de edad de ratones C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Eutanasia a los ratones con inhalación de isoflurano al 5% y luego transfiera los cachorros al etanol al 70%.</li>
	<li>Transfiera el cachorro sacrificado a un plato de cultivo no tratado.</li>
	<li>Usando tijeras y pinzas, agarre la piel en la base del cráneo y haga una incisión.</li>
	<li>Usando la primera incisión como punto de partida, corte en ambos lados laterales del cráneo frente a las orejas, retire la piel y exponga la calvaria.</li>
	<li>Sostenga la cabeza desde el puente nasal y corte la calvaria a lo largo de la sutura lambdoidea. Corte a lo largo de los bordes laterales de los huesos parietales y extiéndalo para incluir la parte frontal.</li>
	<li>Separe la calvaria del tejido cerebral subyacente. NOTA: Para asegurar una calvaria ósea limpia con una unión mínima de tejidos blandos, no corte profundamente en el hueso; Como referencia, uno debería poder ver la sombra de las tijeras debajo del hueso.</li>
	<li>Transfiera la calvaria a solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.4 durante todo el protocolo). Asegúrese de que la parte cóncava esté orientada hacia arriba.</li>
</ol>2. Fraccionamiento de calvaria de ratón recién nacido
<ol><li>Transfiera hasta 5 calvarias a un tubo cónico de 50 ml que contenga 5 ml de solución de colagenasa de 2 mg/ml. Use una solución fresca de colagenasa preparada justo antes de usar.<ol><li>Para preparar una solución fresca de colagenasa, agregue polvo de colagenasa al tampón de aislamiento (70 mM de NaCl, 10 mM de NaHCO 3, 60 mM de sorbitol,3 mM K 2 HPO4, 1 mM de CaCl 2, 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), 5 mg/ml de glucosa y 25 mM de HEPES) a2mg/ml. Disuelva el polvo de colagenasa en un agitador magnético.</li>
		<li>Pase la solución de colagenasa a través de una unidad de filtro estéril de 0,22 μm en un tubo de 50 ml y manténgala en hielo durante todo el protocolo.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar la calvaria a 37 °C durante 20 min en un agitador a 300 rpm para obtener la fracción 1.</li>
	<li>Deseche la digestión de la fracción 1, lave la calvaria con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y deseche el lavado.</li>
	<li>Incubar la calvaria en 5 ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de 5 mM que contenga 1 mg/ml de BSA en PBS, pH 7,4 a 37 °C durante 15 min en un agitador a 300 rpm.</li>
	<li>Recoja el digest en un tubo cónico de 50 ml. Lave la calvaria con 5 ml de PBS y agregue la solución de lavado al digerido. NOTA: En cada punto de recolección del digest y lavado, pipetear los huesos en su solución para separar las células del hueso y evitar dobletes y agregados celulares.</li>
	<li>Para obtener la fracción 2, centrifugar el digest a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 8 ml de medio esencial mínimo (MEM) de α que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 UI / ml de penicilina G y 100 μg / ml de estreptomicina. Semilla en una placa de cultivo de 10 cm. Incubar la fracción 2 a 37 °C bajo 5% deCO2.</li>
	<li>Incubar la calvaria en 5 ml de solución de colagenasa a 37 °C durante 20 min en un agitador a 300 rpm.</li>
	<li>Para recopilar la fracción 3, repita los pasos 2.5\u20122.6. Incubar la fracción 3 a 37 °C bajo 5% deCO2. NOTA: En este punto, los huesos se harán más pequeños y se reducirán a fragmentos. Para asegurarse de que ningún hueso se aspire accidentalmente en los digeridos, lo que conduce a la pérdida de células en el proceso, use una pipeta de punta pequeña para recolectar los resúmenes (puntas de pipeta de 1000-200 μL).</li>
	<li>Incubar la calvaria en 5 ml de solución de colagenasa a 37 °C durante 20 min en un agitador a 300 rpm.</li>
	<li>Para recopilar la fracción 4, repita los pasos 2.5\u20122.6. Incubar la fracción 4 a 37 °C bajo 5% deCO2.</li>
	<li>Incubar la calvaria en 5 ml de 5 mM EDTA que contengan 1 mg/ml de BSA en PBS (pH 7,4) a 37 °C durante 15 min en un agitador a 300 rpm.</li>
	<li>Para recopilar la fracción 5, repita los pasos 2.5\u20122.6. Incubar la fracción 5 a 37 °C bajo 5% deCO2. Los osteocitos pueden prepararse para la clasificación el mismo día o cultivarse hasta 24 h antes de la clasificación.</li>
</ol>3. Preparación de osteocitos para la clasificación celular activada por fluorescencia
<ol><li>Aspirar el medio de cada fracción celular y lavar suavemente con 10 ml de PBS dos veces.</li>
	<li>Añadir 5 ml de tripsina-EDTA al 0,5% en PBS e incubar las células durante 5 min a 37 °C. Agregue 5 ml de FBS al 10% α-MEM y pipete para separar las células suavemente. Combine las células en cada fracción tamizando a través de un filtro celular de 40 μm en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml.</li>
	<li>Lave las células con 10 ml de PBS y recójalas tamizando a través de un filtro celular de 40 μm en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y agregue un 10% de FBS α-MEM al pellet. Ajustar la concentración celular a aproximadamente 1 x 107 células/ml.</li>
	<li>Filtre las celdas en un tubo tapado de malla de nylon de 35 μm. Las células ya están listas para el sistema de control del control de los bienes sobre el terreno.</li>
	<li>Para este protocolo, utilice una boquilla de tamaño de 100 μm. El fluido de recolección debe consistir en un 10% de FBS α-MEM. Conservar la muestra que se está clasificando en agitación y, si es posible, a 4 °C durante toda la clasificación.</li>
	<li>Antes de la clasificación, optimice la activación para eliminar artefactos y celdas ajustando el área de dispersión lateral (SSC) y el área de dispersión directa (FSC). Elimine los dobletes ajustando SSC-width vs SSC-Height y FSC-area vs FSC-width. Los osteocitos GFP negativos deben utilizarse como control para ajustar los parámetros del instrumento de clasificación.</li>
	<li>Una vez completada la recolección de células, centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 10 min. Lave las celdas con PBS. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Vuelva a suspender las celdas y ajuste el número como desee utilizando 10% FBS α-MEM.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+Wnt/&#946;-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis.">Osteocyte Wnt/&#946;-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li><li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. 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P., Varma, S., Gottesman, M. 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Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El primer osteocito aislado fue de una calvaria de pollo 7 aislada mediante el uso (OB7.3) o la variante aviantede PHEX; Sin embargo, este método está limitado por la disponibilidad de anticuerpos viables, ya que se deben fabricar anticuerpos específicos de osteocitos que también son específicos de la especie. Los investigadores utilizaron una modificación diferente del proceso enzimático secuencial para obtener osteocitos de huesos largos de ratón y rata; La pureza reportada de estas cult...

Los osteocitos son células terminalmente diferenciadas de progenitores osteoblásticos que se incrustaron en su matriz secretada1. Son las células más abundantes y longevas entre las poblaciones de células óseas. Residen dentro de lagunas y tienen una morfología estrellada característica con dendritas que se extienden a través de canales llamados canalículos formando una extensa red de comunicación e intercambio metabólico con su entorno circundante y la superficie ósea2. Los osteocitos coreografian tanto osteoblastos como osteoclastos en la remodelación ósea, son las células mecanosensoriales primarias que confieren adaptación a la carga mecánica3, intervienen en la homeostasis del fosfato4 y en la mineralización de la matriz ósea5, y junto con el sistema lacunocanalicular, actúan como órgano endocrino que señala tejidos distantes6.
Los osteocitos están situados dentro de una matriz mineralizada, lo que limita la accesibilidad y dificulta su aislamiento, lo que dificulta la investigación in vitro. Uno de los primeros métodos de aislamiento describió osteocitos aislados de calvaria de pollo utilizando un anticuerpo monoclonal específico de osteocitos (OB7.3)7 que más tarde se supo que era la variante aviar de PHEX (gen regulador de PHosphate con homología a endopeptidasas en el cromosoma X)8. Otros investigadores utilizaron la digestión secuencial de huesos largos de rata 9 o ratón 10 para obtener fracciones ricas en osteocitos en las que se informó que la pureza de los osteocitos era de alrededor del70%9. Las limitaciones de este procedimiento incluyen la pureza subóptima de los cultivos contaminados con otros tipos de células además de los osteocitos y que los osteocitos podrían ser potencialmente sobrecultivados por otras células en cultivo ya que los osteocitos han perdido la capacidad de dividirse. Estos desafíos restringen la usabilidad de las culturas a largo plazo.
Para superar estas limitaciones, se desarrollaron diferentes líneas celulares de osteocitos. La línea celular MLO-Y411 y la línea celular MLO-A512 son, en particular, las líneas celulares más estudiadas que son útiles para el estudio de los osteocitos en etapa temprana; sin embargo, son menos útiles para estudiar la señalización de osteocitos maduros, ya que expresan bajos niveles de esclerostina y FGF2313, los cuales son marcadores de osteocitos maduros. Otras líneas celulares, incluidas IDG-SW314 y Ocy45415, expresan altos niveles de esclerostina y FGF23 y son útiles para estudiar la etapa tardía de osteocitos. Las líneas celulares demuestran ser herramientas de investigación útiles; Sin embargo, no vienen sin limitaciones, ya que no representan completamente la biología de la célula primaria. Diferentes líneas celulares representan diferentes etapas de desarrollo del espectro de madurez de los osteocitos, y las líneas celulares no representan la heterogeneidad de los osteocitos primarios16,17.
Para obtener cultivos puros de osteocitos primarios, los investigadores aprovecharon el modelo de ratón cre en el que se utiliza el promotor dmp1 de 8 kb para impulsar la expresión de proteína fluorescente verde (GFP) en osteocitos18,19. Para obtener poblaciones de osteocitos se han utilizado ratones transgénicos duales (pOB-Col 2.3-GFP-cian y DMP1-GFP-topaz) por Paic et al.19 y ratones transgénicos dmp1-topacio por Nakashima et al.20. En el que emplearon digestión secuencial y FACS de osteocitos que expresan GFP para adquirir cultivos de osteocitos primarios19,20. Se demostró que la dirección de cre en el ratón reportero dmp1 de 10 kb Ai9, que activa la proteína tdTomato, está presente en osteocitos, osteoblastos, músculos y células dentro de la médula ósea. El promotor dmp1 de 8 kb tenía el mismo patrón de expresión, pero sólo una proporción de osteoblastos y células de médula ósea expresaba la proteína, lo que indica que el promotor dmp1 de 8 kb es más específico21. A pesar de esto, los resultados obtenidos utilizando el promotor dmp1 de 8 kb deben interpretarse con precaución, y los perfiles de expresión génica deben llevarse a cabo de forma rutinaria utilizando marcadores específicos de osteocitos frente a osteoblastos para garantizar que la población obtenida sea de pureza lo suficientemente alta.
Los marcadores de osteoclastos OSCAR y Dcstamp se encontraron en poblaciones hematopoyéticas de osteocitos no agotados frente a poblaciones de osteocitos agotados, este hallazgo llevó a los autores a concluir que los digerios obtenidos del fraccionamiento de la calvaria neonatal de 8 kb dmp1-topacio y la clasificación de GFP están contaminados con células hematopoyéticas. La contaminación con células hematopoyéticas podría haberse mitigado apretando la puerta de clasificación de GFP, ya que las células hematopoyéticas positivas para GFP tenían una intensidad de GFP razonablemente menor que las células mesenquimales positivas para GFP (osteocitos)22.
Los métodos para estudiar los osteocitos in vitro han contribuido a la reciente riqueza de información sobre la biología de los osteocitos. Sin embargo, el aislamiento de osteocitos sigue siendo un procedimiento laborioso y prolongado con bajos rendimientos celulares. El método descrito de digestión ósea utilizando colagenasa y EDTA a menudo hasta la fracción 823, toma varias horas en las que se grava la viabilidad de los osteocitos. Los investigadores han reportado el uso de fracciones (2-20125) para la clasificación celular 20, y han demostrado que el perfil de expresión de genes asociados con los osteocitos frente a los de los osteoblastos confirma el éxito de aislar poblaciones de osteocitos puros20. En este artículo, describimos el proceso de obtención de fracciones (2-0125), y comparamos el rendimiento de los osteocitos de cada fracción comenzando con la fracción 1 a la 8 para determinar el retorno de los osteocitos en cada fracción. También describimos la disección de la calvaria del ratón dmp1-topacio recién nacido y la digestión calvarial utilizando colagenasa y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), así como la preparación de células para FACS.

<table><tbody><tr><td>BD FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Data aquisition and analysis</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &amp;mu;m nylon mesh.</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td>034-22363</td><td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td><td></td><td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Biowest, Nuaill&amp;eacute;, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation buffer</td><td></td><td></td><td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Millex Sterile Filter Unit</td><td>Merck Millipore, Ireland</td><td>SLGV033RS</td><td>0.22&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Nylon cell strainer</td><td>FALCON, NY, USA</td><td></td><td>40&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies, NY, USA</td><td></td><td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td></td><td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &amp;mu;g/ml streptomycin</td></tr></tbody></table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

El osteocito, que una vez se pensó que era un residente pasivo del hueso dada la función detrás del escenario de detectar la carga mecánica, ahora se pone en el centro de atención y se ha demostrado que tiene múltiples funciones principales, como modificar activamente la matriz extracelular y formar un órgano endocrino con el sistema lacunocanalicular que lo encierra enviando mensajes a sitios distantes. Debido a los métodos que permitieron probar el osteocito in vitro desde el aislamiento de osteocitos primarios hasta líneas celulares similares a los osteocitos, los osteocitos están experimentando un interés rotundo y una oleada de conocimiento sobre estructura y función. Muchos aspectos de la biología de los osteocitos y la interacción con otros componentes moleculares aún no se han descubierto. En este protocolo, describimos en detalle el aislamiento eficiente de osteocitos primarios de calvaria de ratón neonatal dmp1-topacio, que expresan la proteína verde fluorescente en los osteocitos, mediante fraccionamiento celular y posteriormente adquiriendo cultivos de osteocitos primarios por FACS.

El propósito de este protocolo es demostrar el proceso de obtención de cultivos de osteocitos primarios de calvaria de ratón neonatal dmp1-topacio a través de un proceso de fraccionamiento utilizando colagenasa para degradar la matriz de colágeno y EDTA para la quelación del calcio, después de lo cual las células se preparan para FACS para separar los osteocitos de otras poblaciones celulares.
Los métodos para obtener osteocitos primarios de calvaria de ratón neonatal a menudo descri...

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Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Este protocolo describe la disección de calvaria de ratón dmp1-topacio neonatal y el aislamiento de osteocitos que expresan la proteína verde fluorescente a través de la digestión celular y el fraccionamiento, además de la preparación de osteocitos para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

Obtención de osteocitos primarios mediante fraccionamiento calvarial murino de osteocitos que expresan GFP

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

2.0K vistas.  Tohoku University Graduate School of Dentistry. Este protocolo describe la disección de calvaria de ratón dmp1-topacio neonatal y el aislamiento de osteocitos que expresan la proteína verde fluorescente a través de la digestión celular y el fraccionamiento, además de la preparación de osteocitos para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

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Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Secuencial<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Medicina

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of therapies to enhance fracture healing.&#160; Periosteal cells rapidly migrate to an injury to supply new chondrocytes and osteoblasts for fracture healing. Traditionally, the efficacy of a cytokine to induce cell migration has only been conducted in vitro by performing a transwell or scratch assay. With advancements in intravital microscopy using multiphoton excitation, it was recently discovered that 1) P-SSCs express the migratory gene CCR5 and 2) treatment with the CCR5 ligand known as CCL5 improves fracture healing and the migration of P-SSCs in response to CCL5. These results have been captured in real-time. Described here is a protocol to visualize P-SSC migration from the calvarial suture skeletal stem cell (SSC) niche towards an injury after treatment with CCL5. The protocol details the construction of a mouse restraint and imaging mount, surgical preparation of the mouse calvaria, induction of a calvaria defect, and acquisition of time-lapse imaging.

This protocol describes the detection of CCL5-mediated periosteal skeletal stem cell migration in real-time using live animal intravital microscopy.

Imágenes en tiempo real de la migración inducida por CCL5 de células madre esqueléticas periósticas en ratones

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

A Fluorescent Intravital Imaging Approach to Study Load-Induced Calcium Signaling Dynamics in Mouse Osteocytes

Bone tissue is exquisitely sensitive to differences in mechanical load magnitude. Osteocytes, dendritic cells that form a syncytium throughout the bone, are responsible for the mechanosensory function of bone tissue. Studies employing histology, mathematical modeling, cell culture, and ex vivo bone organ cultures have greatly advanced the understanding of osteocyte mechanobiology. However, the fundamental question of how osteocytes respond to and encode mechanical information at the molecular level in vivo is not well understood. Intracellular calcium concentration fluctuations in osteocytes offer a useful target for learning more about acute bone mechanotransduction mechanisms. Here, we report a method for studying osteocyte mechanobiology in vivo, combining a mouse strain with a fluorescently genetically encoded calcium indicator expressed in osteocytes with an in vivo loading and imaging system to directly detect osteocyte calcium levels during loading. This is achieved with a three-point bending device that can deliver well-defined mechanical loads to the third metatarsal of living mice while simultaneously monitoring fluorescently indicated calcium responses of osteocytes using two-photon microscopy. This technique allows for direct in vivo observation of osteocyte calcium signaling events in response to whole bone loading and is useful in the endeavor to reveal mechanisms in osteocyte mechanobiology.

The current article describes performing an intravital imaging approach to observe mechanically induced calcium signaling of embedded osteocytes in vivo in real-time in response to tissue-level mechanical loading of the mouse third metatarsal.

Bone tissue is exquisitely sensitive to differences in mechanical load magnitude. Osteocytes, dendritic cells that form a syncytium throughout the bone, ...

Bioingeniería

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

La aplicación de ácido retinoico para obtener cultivos de osteocitos principal del ratón osteoblastos

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Biología

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modelado 3D de osteocitos para análisis CFD para el estudio de la mecanosensación en el hueso

Analysis and Imaging of Osteocytes

Osteocytes are the bone cells that are thought to respond to mechanical strains and fluid flow shear stress (FFSS) by activating various biological pathways in a process known as mechanotransduction. Confocal image-derived models of osteocyte networks are a valuable tool for conducting Computational Fluid Dynamics&#160;(CFD) analysis to evaluate shear stresses on the osteocyte membrane, which cannot be determined by direct measurement. Computational modeling using these high-resolution images of the microstructural architecture of bone was used to numerically simulate the mechanical loading exerted on bone and understand the load-induced stimulation of osteocytes.
This study elaborates on the methods to develop 3D single osteocyte models using confocal microscope images of the Lacunar-Canalicular Network&#160;(LCN) to perform CFD analysis utilizing various computational modeling software. Prior to confocal microscopy, the mouse bones are sectioned and stained with Fluorescein isothiocyanate (FITC) dye to label the LCN. At 100x resolution, Z-stack images are collected using a confocal microscope and imported into MIMICS software (3D image-based processing software) to construct a surface model of the LCN and osteocyte-dendritic processes.
These surfaces are then subtracted using a Boolean operation in 3-Matic software (3D data optimization software) to model the lacunar fluidic space around the osteocyte cell body and canalicular space around the dendrites containing lacunocanalicular fluid. 3D volumetric fluid geometry is imported into ANSYS software (simulation software) for CFD analysis. ANSYS CFX (CFD software) is used to apply physiological loading on the bone as fluid pressure, and the wall shear stresses on the osteocytes and dendritic processes are determined. The morphology of the LCN affects the shear stress values sensed by the osteocyte cell membrane and cell processes. Therefore, the details of how confocal image-based models are developed can be valuable in understanding osteocyte mechanosensation and can lay the groundwork for future studies in this area.

<meta charset="utf8"></head><body>Análisis e imagen de osteocitos

This study outlines the method to visualize and develop three-dimensional (3D) models of osteocytes within the lacunar-canalicular network (LCN) for computational fluid dynamics (CFD) analysis. The generated models using this method help to understand osteocyte mechanosensation in healthy or diseased bones.

Análisis e imagen de osteocitos

Osteocytes are the bone cells that are thought to respond to mechanical strains and fluid flow shear stress (FFSS) by activating various biological ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Obtención de osteocitos primarios mediante fraccionamiento calvarial murino de osteocitos que expresan GFP

Resumen

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Capítulos en este video

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Secuencial

Imágenes en tiempo real de la migración inducida por CCL5 de células madre esqueléticas periósticas en ratones

A Fluorescent Intravital Imaging Approach to Study Load-Induced Calcium Signaling Dynamics in Mouse Osteocytes

La aplicación de ácido retinoico para obtener cultivos de osteocitos principal del ratón osteoblastos

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Análisis e imagen de osteocitos

Análisis e imagen de osteocitos

Análisis e imagen de osteocitos

Osteoclastos Derivación de médula ósea de ratón