이 연구는 일본 과학 진흥 협회 (H.K.에 No. 19K10397, I.M.에 No. 18K09862)의 JSPS KAKENHI 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

모든 동물 시술과 동물 관리는 도호쿠 대학의 규칙과 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 신생아 dmp1-topaz 마우스 calvaria의 해부
<ol><li>이 프로토콜의 경우 C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J 마우스의 6-1일 된 새끼를 사용합니다. 5% 이소플루란 흡입으로 마우스를 안락사시킨 다음 새끼를 70% 에탄올로 옮깁니다.</li>
	<li>안락사된 강아지를 처리되지 않은 배양 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>가위와 핀셋을 사용하여 두개골 바닥의 피부를 잡고 절개하십시오.</li>
	<li>첫 번째 절개를 시작점으로 하여 귀 앞쪽 두개골의 양쪽 측면을 절단하고 피부를 제거하고 두개골을 노출시킵니다.</li>
	<li>비강 다리에서 머리를 잡고 lambdoid 봉합사를 따라 calvaria를 자릅니다. 정수리 뼈의 측면 가장자리를 따라 자르고 정면 부분을 포함하도록 확장합니다.</li>
	<li>밑에있는 뇌 조직에서 calvaria를 분리하십시오. 알림: 최소한의 연조직 부착으로 깨끗한 뼈 두개골을 보장하려면 뼈 깊숙이 자르지 마십시오. 참고로 뼈 아래 가위의 그림자를 볼 수 있어야 합니다.</li>
	<li>calvaria를 인산염 완충 식염수(PBS, 프로토콜 전반에 걸쳐 pH 7.4)로 옮깁니다. 오목한 부분이 위쪽을 향하고 있는지 확인하십시오.</li>
</ol>2. 신생아 마우스 calvaria의 분획
<ol><li>5 mL의 2 mg/mL 콜라게나제 용액이 들어 있는 50 mL 원뿔형 튜브에 최대 5개의 calvariae를 옮깁니다. 사용 직전에 준비된 신선한 콜라게나제 용액을 사용하십시오.<ol><li>신선한 콜라게나제 용액을 제조하기 위해, 콜라게나제 분말을 2 mg/mL의 분리 완충액(70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM 소르비톨,3 mM K 2 HPO4, 1 mM CaCl2, 1 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA), 5 mg/mL 포도당 및 25 mM HEPES)에 첨가한다. 콜라게나제 분말을 자석 교반기에 녹입니다.</li>
		<li>0.22μm 멸균 필터 장치를 통해 콜라게나제 용액을 50mL 튜브에 넣고 프로토콜 내내 얼음 위에 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>칼바리아를 37°C에서 300rpm의 진탕기 상에서 20분 동안 인큐베이션하여 분획 1을 얻었다.</li>
	<li>분획 1의 분해물을 버리고, 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 칼바리아를 세척한 후 세척액을 폐기합니다.</li>
	<li>300rpm의 진탕기에서 15분 동안 37°C에서 PH 7.4의 PBS, PH 7.4에 1mg/mL BSA를 포함하는 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 5mL에 칼바리아를 배양합니다.</li>
	<li>50mL 원뿔형 튜브에 다이제스트를 수집합니다. 5mL의 PBS로 calvaria를 세척하고 세척 용액을 소화제에 첨가하십시오. 참고: 소화제를 수집하고 세척하는 각 지점에서 용액에 뼈를 피펫팅하여 뼈에서 세포를 분리하고 이중선 및 세포 응집체를 방지합니다.</li>
	<li>분획 2를 얻기 위해, 분해물을 4°C에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 10% 소 태아 혈청(FBS), 100IU/mL 페니실린 G 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 함유한 8mL의 α-최소 필수 배지(MEM)에 펠릿을 다시 현탁합니다. 10cm 배양 접시에 씨앗을 뿌린다. 분획 2를 5%CO2 하에 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>칼바리아를 37°C에서 300 rpm의 진탕기 상에서 20분 동안 37°C에서 5 mL의 콜라게나제 용액에 인큐베이션한다.</li>
	<li>분수 3을 구하려면 2.5-6단계를 반복합니다. 분획 3을 5%CO2 하에 37°C에서 배양한다. 알림: 이 시점에서 뼈는 작아지고 조각으로 축소됩니다. 뼈가 실수로 분해물로 흡인되어 공정에서 세포 손실이 발생하지 않도록 하려면 분해물을 수집할 때 작은 팁 피펫(1000\u2012200 μL 피펫 팁)을 사용하십시오.</li>
	<li>칼바리아를 37°C에서 300 rpm의 진탕기 상에서 20분 동안 37°C에서 5 mL의 콜라게나제 용액에 인큐베이션한다.</li>
	<li>분수 4를 수집하려면 2.5-6단계를 반복합니다. 분획 4를 5%CO2 하에 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>300rpm의 진탕기에서 15분 동안 37°C에서 PBS(pH 7.4) 중 1mg/mL BSA를 포함하는 5mM EDTA 5mL에서 칼바리아를 배양합니다.</li>
	<li>분수 5를 수집하려면 2.5-6단계를 반복합니다. 분획 5를 5%CO2 하에 37°C에서 배양한다. Osteocytes는 같은 날 분류를 위해 준비하거나 분류 전에 최대 24시간 동안 배양할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 형광 활성화 세포 분류를 위한 골세포의 제조
<ol><li>각 세포 분획의 배지를 흡인하고 PBS 10mL로 부드럽게 세척합니다.</li>
	<li>PBS에 0.5% Trypsin-EDTA 5mL를 넣고 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 5mL의 10% FBS α-MEM과 피펫을 추가하여 세포를 부드럽게 분리합니다. 40μm 세포 여과기를 통해 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브에 체로 쳐서 각 분획의 세포를 결합합니다.</li>
	<li>10mL의 PBS로 세포를 세척하고 40μm 세포 여과기를 통해 50mL 원추형 원심분리기 튜브에 체로 쳐서 수집합니다. 세포를 4°C에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 흡인하고 펠릿에 10% FBS α-MEM을 추가합니다. 세포 농도를 약 1 x 107 cells/mL로 조정합니다.</li>
	<li>35μm 나일론 메쉬 캡 튜브에서 세포를 여과합니다. 이제 셀이 FACS에 대한 준비가 되었습니다.</li>
	<li>이 프로토콜의 경우 100μm 크기의 노즐을 사용합니다. 수집 유체는 10% FBS α-MEM으로 구성되어야 합니다. 교반 중에 분류되는 샘플을 유지하고 가능하면 분류 내내 4°C에서 유지합니다.</li>
	<li>정렬하기 전에 측면 산란(SSC) 영역과 전방 산란(FSC) 영역을 조정하여 아티팩트와 셀을 제거하도록 게이팅을 최적화합니다. SSC-너비 대 SSC-높이 및 FSC-영역 대 FSC-너비를 조정하여 이중선을 제거합니다. GFP 음성 골세포는 분류 기기의 매개변수를 조정하기 위한 대조군으로 사용해야 합니다.</li>
	<li>세포 수집이 완료된 후, 세포를 4°C에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. PBS로 세포를 세척하십시오. 세포를 4°C에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>셀을 다시 일시 중단하고 10% FBS α-MEM을 사용하여 원하는 대로 숫자를 조정합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+Wnt/&#946;-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis.">Osteocyte Wnt/&#946;-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li><li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. 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P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+(TSI).">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation,+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene.">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression.">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li><li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

최초로 분리된 골세포는 닭 calvaria7 (OB7.3) 또는 PHEX의 조류 변이체를 사용하여 분리하였다; 그러나, 이 방법은 또한 종 특이적인 골세포 특이적 항체가 제조되어야 하기 때문에 실행 가능한 항체의 가용성에 의해 제한됩니다. 연구자들은 마우스와 쥐의 긴 뼈에서 골 세포를 얻기 위해 순차적 효소 과정의 다른 변형을 사용했습니다. 보고된 이러한 배양물의 순도는 약 70%로 설정되?...

Osteocytes는 분비된 기질1에 묻힌 조골세포 전구체로부터 말단적으로 분화된 세포입니다. 그들은 뼈 세포 집단 중에서 가장 풍부하고 가장 오래 사는 세포입니다. 그들은 lacunae 내에 거주하며 주변 환경 및 뼈 표면과의 광범위한 통신 및 대사 교환 네트워크를 형성하는 canaliculi라는 채널을 통해 확장되는 수상 돌기와 함께 특징적인 별 모양 형태를 가지고 있습니다2. 골세포는 뼈 리모델링에서 조골세포와 파골세포 역할을 모두 수행하며,기계적 부하에 대한 적응을 부여하는 주요 기계감각 세포이며3, 인산염 항상성(phosphate homeostasis)4 및 골기질 광물화(bone matrix mineralization)5에 관여하며, 열수관(lacunocanalicular) 시스템과 함께 먼 조직에 신호를 보내는 내분비 기관으로 작용한다6.
Osteocytes는 광물화된 매트릭스 내에 위치하여 접근성을 제한하고 분리를 어렵게 만들어 체외 조사를 방해합니다. 첫 번째 분리 방법 중 하나는 나중에 PHEX(X 염색체의 엔도펩티다아제와 상동성을 갖는 PHosphate-regulating gene)8의 조류 변이체로 알려진 골세포 특이적 단클론 항체(OB7.3)를 사용하여 닭 두개골에서 골세포를 분리하는 것이었습니다. 다른 연구자들은 쥐9 또는 마우스 10 긴 뼈의 순차적 소화를 사용하여 골세포 순도가 약70 %인 것으로 보고된 골세포가 풍부한 분획을 얻었습니다9. 이 절차의 한계에는 골세포 이외의 다른 세포 유형으로 오염된 배양물의 최적이 아닌 순도와 골세포가 분열하는 능력을 상실했기 때문에 배양 중인 다른 세포에 의해 골세포가 잠재적으로 과도하게 자랄 수 있다는 것이 포함됩니다. 이러한 문제는 장기 문화의 유용성을 제한합니다.
이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 골세포 세포주가 개발되었습니다. MLO-Y4 세포주11 및 MLO-A5 세포주12는 특히 초기 단계 골세포 연구에 유용한 가장 널리 연구된 세포주입니다. 그러나 이들은 성숙한 골세포 마커인 sclerostin과 FGF2313의 낮은 수준을 발현하기 때문에 성숙한 골세포 신호 전달을 연구하는 데 덜 유용하다. IDG-SW314 및 Ocy45415를 포함하는 다른 세포주는 높은 수준의 스클레로스틴 및 FGF23을 발현하며 후기 골세포 단계를 연구하는 데 유용합니다. 세포주는 유용한 연구 도구임이 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 일차 세포의 생물학을 완전히 나타내지 않기 때문에 제한없이 오지 않습니다. 상이한 세포주는 골세포 성숙 스펙트럼의 상이한 발달 단계를 나타내며, 세포주는 원발성 골세포의 이질성을 나타내지 못한다16,17.
일차 골세포의 순수 배양을 얻기 위해, 연구자들은 8kb dmp1 프로모터가 골세포에서 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 유도하는 데 사용되는 cre 마우스 모델을 활용했다18,19. Paic et al.19에 의한 이중 형질전환 마우스(pOB-Col 2.3-GFP-cyan 및 DMP1-GFP-topaz)와 Nakashima et al.20에 의한 dmp1-topaz 형질전환 마우스를 사용하여 골세포 개체군을 얻었습니다. 그들은 1차 골세포의 배양물을 획득하기 위해 GFP를 발현하는 골세포의 순차적 소화 및 FACS를 사용했습니다19,20. tdTomato 단백질을 활성화시키는 10kb dmp1 리포터 마우스 Ai9에서 cre의 방향은 골수, 조골세포, 근육 및 골수 내 세포에 존재하는 것으로 나타났습니다. 8-kb dmp1 프로모터는 동일한 발현 패턴을 가졌지만, 조골세포와 골수 세포의 일부만이 단백질을 발현하였으며, 이는 8-kb dmp1 프로모터가 더 특이적임을 나타낸다21. 그럼에도 불구하고, 8kb dmp1 프로모터를 사용하여 얻은 결과는 주의해서 해석되어야 하며, 유전자 발현 프로파일은 얻어진 집단이 충분히 높은 순도를 갖도록 하기 위해 골세포 대 조골세포 특이적 마커를 사용하여 일상적으로 수행되어야 합니다.
파골세포 마커 OSCAR 및 Ddcamp는 조혈되지 않은 고갈 대 고갈된 골세포 집단에서 발견되었으며, 이 발견으로 인해 저자는 8kb dmp1-topaz 신생아 calvaria 및 GFP 분류의 분획에서 얻은 소화가 조혈 세포로 오염되어 있다고 결론지었습니다. GFP 양성 조혈 세포는 GFP 양성 중간엽 세포(골세포)보다 GFP 강도가 상당히 낮기 때문에 조혈 세포의 오염은 GFP 분류 게이트를 조임으로써 완화될 수 있었습니다22.
시험관 내에서 골세포를 연구하는 방법은 골세포 생물학에 대한 최근의 풍부한 정보에 기여했습니다. 그러나 골세포 분리는 세포 수율이 낮은 노동 집약적이고 긴 절차로 남아 있습니다. 콜라게나제와 EDTA를 사용하여 종종 분획 823까지 뼈 소화의 설명 된 방법은 골 세포 생존력에 세금이 부과되는 몇 시간이 걸립니다. 연구자들은 세포 분류를 위해 분획(fractions)(2\u20125)을 사용했다고 보고했으며20, 조골세포와 관련된 유전자의 발현 프로필과 조골세포의 유전자 발현 프로필이 순수한 골세포 개체군을 분리하는 데 성공했음을 확인해준다는 것을 보여주었다20. 이 기사에서는 분획(2\u20125)을 얻는 과정을 설명하고 분획 1부터 8까지 시작하는 각 분획의 골세포 수율을 비교하여 각 분획에서 골세포의 반환을 결정합니다. 우리는 또한 신생아 dmp1-topaz 마우스 calvaria의 해부와 collagenase 및 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)를 사용한 calvarial 소화뿐만 아니라 FACS를위한 세포의 준비에 대해 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Data aquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &#956;m nylon mesh.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAriaTM II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore, Ireland</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>FALCON, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>40&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

한때 기계적 부하를 감지하는 무대 뒤 기능을 감안할 때 뼈의 수동적 거주자로 생각되었던 골 세포는 이제 주목을 받고 있으며 세포 외 기질을 능동적으로 수정하고 내분비 기관을 형성하는 것과 같은 여러 주요 기능을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 시험관 내에서 분리된 일차 골세포에서 골세포 유사 세포주로 골세포를 테스트할 수 있게 된 방법 덕분에 골세포는 이제 구조와 기능에 대한 엄청난 관심과 지식의 급증을 경험하고 있습니다. 골세포 생물학의 많은 측면과 다른 분자 구성 요소와의 상호 작용은 아직 발견되지 않았습니다. 이 프로토콜에서 우리는 세포 분획 및 이후 FACS에 의한 1차 골세포의 배양을 통해 골세포에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 dmp1-topaz 신생아 마우스 calvaria에서 1차 골세포의 효율적인 분리를 자세히 설명합니다.

이 프로토콜의 목적은 칼슘 킬레이트화를 위해 콜라겐 매트릭스 및 EDTA를 분해하기 위해 콜라게나제를 사용하는 분획 과정을 통해 dmp1-topaz 신생아 마우스 종아리에서 1차 골세포의 배양을 얻는 과정을 입증하는 것이며, 그 후 세포는 다른 세포 집단에서 골세포를 분리하기 위해 FACS를 위해 준비됩니다.
신생아 마우스 calvaria에서 일차 골세포를 얻는 방법은 종종 분류를 위한 ?...

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Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 골세포 준비 외에도 신생아 dmp1-topaz 마우스 두개골의 해부와 세포 소화 및 분획을 통해 녹색 형광 단백질을 발현하는 골세포의 분리를 설명합니다.

GFP 발현 골세포의 쥐 두개골 분획을 통한 1차 골세포 획득

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

2.0K 조회수.  Tohoku University Graduate School of Dentistry. 이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 골세포 준비 외에도 신생아 dmp1-topaz 마우스 두개골의 해부와 세포 소화 및 분획을 통해 녹색 형광 단백질을 발현하는 골세포의 분리를 설명합니다.

비디오: Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Xenopus laevis 여성의 난자를 구하기

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

연구

생물학

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis 에그의 작성과 분류는 압축을 풉니다

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

자기편 및 비 점착 성의 포유 동물 세포의 현장 Subcellular 분별 (분리)에서

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

기본 마우스 조골 세포에서 골 세포 배양을 구하는 레티노 산의 적용

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the mitochondrial genome. MDPs have a wide variety of biological effects such as protecting neurons from apoptosis, improving metabolic markers, and protecting cells from chemotherapy. Humanin was the first MDP to be discovered and is the most studied peptide among the MDP family. The membrane receptors and downstream signaling pathways of humanin have been carefully characterized. Additional MDPs such as MOTS-c and SHLP1-6 have been more recently discovered and the signaling mechanisms have yet to be elucidated. Here we describe a cell culture based method to determine the function of these peptides. In particular, cell fractionation techniques in combination with western blotting allow for the quantitative determination of activation and translocation of important signaling molecule. While there are other methods of cell fractionation, the one described here is an easy and straightforward method. These methods can be used to further elucidate the mechanism of action of these peptides and other therapeutic agents.

This protocol describes how to stimulate cells with mitochondrial-derived peptides and assess the signaling cascade and localization of phospho-proteins.