Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione JSPS KAKENHI della Japan Society for the Promotion of Science (n. 19K10397 a H.K. e n. 18K09862 a I.M.).

Tutte le procedure e la cura degli animali sono state eseguite in conformità con le regole e i regolamenti dell'Università di Tohoku.
1. Dissezione della calvaria di topo dmp1-topazio neonato
<ol><li>Per questo protocollo, utilizzare 6\u20127 cuccioli di C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Eutanasia topi con inalazione di isoflurano al 5% e quindi trasferire i cuccioli in etanolo al 70%.</li>
	<li>Trasferire il cucciolo eutanasia in un piatto di coltura non trattato.</li>
	<li>Usando forbici e pinzette, afferrare la pelle alla base del cranio e fare un'incisione.</li>
	<li>Usando la prima incisione come punto di partenza, tagliare su entrambi i lati laterali del cranio davanti alle orecchie, rimuovere la pelle ed esporre la calvaria.</li>
	<li>Tenere la testa dal ponte nasale e tagliare la calvaria lungo la sutura lambdoide. Tagliare lungo i bordi laterali delle ossa parietali ed estenderlo per includere la parte frontale.</li>
	<li>Separare il calvario dal tessuto cerebrale sottostante. NOTA: Per garantire un calvario osseo pulito con un attacco minimo dei tessuti molli, non tagliare in profondità l'osso; Per riferimento, si dovrebbe essere in grado di vedere l'ombra delle forbici sotto l'osso.</li>
	<li>Trasferire la calvaria in soluzione salina tamponata fosfato (PBS, pH 7,4 durante tutto il protocollo). Assicurati che la parte concava sia rivolta verso l'alto.</li>
</ol>2. Frazionamento della calvaria di topo appena nata
<ol><li>Trasferire fino a 5 calvario in un tubo conico da 50 mL contenente 5 mL di soluzione di collagenasi 2 mg/mL. Utilizzare una soluzione di collagenasi fresca preparata appena prima dell'uso.<ol><li>Per preparare una soluzione di collagenasi fresca, aggiungere la polvere di collagenasi al tampone isolante (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitolo,3 mM K 2 HPO4, 1 mM CaCl 2, 1 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA), 5 mg/ml di glucosio e 25 mM HEPES) a2mg/ml. Sciogliere la polvere di collagenasi su un agitatore magnetico.</li>
		<li>Far passare la soluzione di collagenasi attraverso un'unità filtrante sterile da 0,22 μm in un tubo da 50 ml e tenerla in ghiaccio per tutta la durata del protocollo.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubare la calvaria a 37 °C per 20 minuti su uno shaker a 300 giri/min per ottenere la frazione 1.</li>
	<li>Scartare il digesto della frazione 1, lavare il calvario con 5 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e gettare il lavaggio.</li>
	<li>Incubare il calvario in 5 mL di acido etilendiamminotetraacetico 5 mM contenente 1 mg/mL di BSA in PBS, PH 7,4 a 37 °C per 15 minuti su uno shaker a 300 rpm.</li>
	<li>Raccogliere il digest in un tubo conico da 50 ml. Lavare la calvaria con 5 ml di PBS e aggiungere la soluzione di lavaggio al digest. NOTA: In ogni punto di raccolta del digesto e lavaggio, pipettare le ossa nella loro soluzione per staccare le cellule dall'osso e per prevenire doppietti e aggregati cellulari.</li>
	<li>Per ottenere la frazione 2, centrifugare il digesto a 300 x g a 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante, risospendere il pellet in 8 ml di α-Minimum Essential Medium (MEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), 100 UI/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina. Seminare su un piatto di coltura di 10 cm. Incubare la frazione 2 a 37 °C sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Incubare il calvario in 5 mL di soluzione di collagenasi a 37 °C per 20 minuti su uno shaker a 300 rpm.</li>
	<li>Per raccogliere la frazione 3, ripetere i passaggi 2.5\u20122.6. Incubare la frazione 3 a 37 °C sotto il 5% di CO2. NOTA: A questo punto, le ossa diventeranno più piccole e saranno ridotte a frammenti. Per garantire che nessuna osso venga aspirato accidentalmente nei digesti, il che porta alla perdita di cellule nel processo, utilizzare una piccola pipetta a punta per la raccolta dei digesti (punte per pipette da 1000-2000 μL).</li>
	<li>Incubare il calvario in 5 mL di soluzione di collagenasi a 37 °C per 20 minuti su uno shaker a 300 rpm.</li>
	<li>Per raccogliere la frazione 4, ripetere i passaggi 2.5\u20122.6. Incubare la frazione 4 a 37 °C sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Incubare il calvario in 5 mL di 5 mM EDTA contenente 1 mg/mL di BSA in PBS (pH 7,4) a 37 °C per 15 minuti su uno shaker a 300 giri/min.</li>
	<li>Per raccogliere la frazione 5, ripetere i passaggi 2.5\u20122.6. Incubare la frazione 5 a 37 °C sotto il 5% di CO2. Gli osteociti possono essere preparati per la selezione nello stesso giorno o coltivati fino a 24 ore prima della selezione.</li>
</ol>3. Preparazione di osteociti per la selezione cellulare attivata a fluorescenza
<ol><li>Aspirare il mezzo di ciascuna frazione cellulare e lavare delicatamente con 10 ml di PBS due volte.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,5% in PBS e incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C. Aggiungere 5 ml di FBS al 10% α-MEM e pipettare per staccare delicatamente le cellule. Combinare le cellule in ciascuna frazione setacciando un filtro cellulare da 40 μm in una provetta conica da centrifuga da 50 ml.</li>
	<li>Lavare le celle con 10 ml di PBS e raccogliere setacciando un filtro cellulare da 40 μm in una provetta conica da centrifuga da 50 ml. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 min.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e aggiungere il 10% di FBS α-MEM al pellet. Regolare la concentrazione cellulare a circa 1 x 107 cellule/ml.</li>
	<li>Filtrare le celle in un tubo con copertura in rete di nylon da 35 μm. Le celle sono ora pronte per FACS.</li>
	<li>Per questo protocollo, utilizzare un ugello di dimensioni 100 μm. Il fluido di raccolta deve essere costituito per il 10% da FBS α-MEM. Mantenere il campione da selezionare in agitazione e a 4 °C in tutto il tipo, se possibile.</li>
	<li>Prima dell'ordinamento, ottimizzare il gating per rimuovere artefatti e celle regolando l'area SSC (side scatter) e l'area FSC (forward scatter). Elimina i doppietti regolando SSC-width vs SSC-Height e FSC-area vs FSC-width. Gli osteociti GFP-negativi dovrebbero essere usati come controllo per regolare i parametri dello strumento di ordinamento.</li>
	<li>Al termine della raccolta delle cellule, centrifugare le cellule a 300 x g a 4 °C per 10 minuti. Lavare le celle con PBS. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 min.</li>
	<li>Risospendere le celle e regolare il numero come desiderato utilizzando il 10% FBS α-MEM.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+Wnt/&#946;-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis.">Osteocyte Wnt/&#946;-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li><li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models.">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro.">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+(TSI).">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation,+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene.">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression.">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li><li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il primo osteocita isolato proveniva da una calvaria di pollo7 isolata utilizzando (OB7.3) o la variante aviant di PHEX; Tuttavia, questo metodo è limitato dalla disponibilità di anticorpi funzionanti, poiché devono essere prodotti anticorpi specifici per osteociti che sono anche specie-specifici. I ricercatori hanno utilizzato una diversa modifica del processo enzimatico sequenziale per ottenere osteociti da ossa lunghe di topo e ratto; La purezza riportata di queste colture è stata fissata a...

Gli osteociti sono cellule terminalmente differenziate dai progenitori osteoblastici che sono stati incorporati nella loro matrice secreta1. Sono le cellule più abbondanti e più longeve tra le popolazioni di cellule ossee. Risiedono all'interno di lacune e hanno una caratteristica morfologia stellata con dendriti che si estendono attraverso canali chiamati canalicoli formando una vasta rete di comunicazione e scambio metabolico con l'ambiente circostante e la superficie ossea2. Gli osteociti coreografano sia i ruoli degli osteoblasti che degli osteoclasti nel rimodellamento osseo, sono le cellule meccanosensoriali primarie che conferiscono adattamento al carico meccanico3, sono coinvolte nell'omeostasi del fosfato4 e nella mineralizzazione della matrice ossea5 e, insieme al sistema lacunocanalicolare, agiscono come un organo endocrino che segnala i tessuti distanti6.
Gli osteociti sono situati all'interno di una matrice mineralizzata, che limita l'accessibilità e rende difficile il loro isolamento, ostacolando così l'indagine in vitro. Uno dei primi metodi di isolamento ha descritto osteociti isolati dalla calvaria di pollo utilizzando un anticorpo monoclonale osteocita-specifico (OB7.3)7 che in seguito è stato conosciuto per essere la variante aviaria di PHEX (PHosphate-regulating gene with homology to Endopeptidases on the X chromosome)8. Altri ricercatori hanno utilizzato la digestione sequenziale delle ossa lunghe del ratto 9 o del topo 10 per ottenere frazioni ricche di osteociti in cui la purezza degli osteociti è stata riportata intorno al70%9. I limiti di questa procedura includono la purezza sub-ottimale delle colture contaminate con altri tipi di cellule oltre agli osteociti e che gli osteociti potrebbero essere potenzialmente ricoperti da altre cellule in coltura poiché gli osteociti hanno perso la capacità di dividersi. Queste sfide limitano l'usabilità delle culture a lungo termine.
Per superare queste limitazioni, sono state sviluppate diverse linee cellulari di osteociti. La linea cellulare MLO-Y411 e la linea cellulare MLO-A512 sono in particolare le linee cellulari più studiate che sono utili per lo studio degli osteociti allo stadio iniziale; tuttavia, sono meno utili per studiare la segnalazione degli osteociti maturi in quanto esprimono bassi livelli di sclerostina e FGF2313, entrambi marcatori di osteociti maturi. Altre linee cellulari, tra cui IDG-SW3 14 e Ocy45415, esprimono alti livelli di sclerostina e FGF23 e sono utili nello studio dello stadio tardivo degli osteociti. Le linee cellulari si rivelano utili strumenti di ricerca; Tuttavia, non sono privi di limitazioni in quanto non rappresentano pienamente la biologia della cellula primaria. Diverse linee cellulari rappresentano diversi stadi di sviluppo dello spettro di maturità degli osteociti e le linee cellulari non riescono a rappresentare l'eterogeneità degli osteociti primari16,17.
Per ottenere colture pure di osteociti primari, i ricercatori hanno sfruttato il modello murino cre in cui il promotore dmp1 da 8 kb viene utilizzato per guidare l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) negli osteociti18,19. Topi transgenici doppi (pOB-Col 2.3- GFP-ciano e DMP1-GFP-topazio) di Paic et al.19 e topi transgenici dmp1-topazio di Nakashima et al.20 sono stati utilizzati per ottenere popolazioni di osteociti. In cui hanno impiegato la digestione sequenziale e FACS di osteociti che esprimono GFP per acquisire colture di osteociti primari19,20. La direzione del cre nel topo reporter Ai9 dmp1 da 10 kb, che attiva la proteina tdTomato, ha dimostrato di essere presente negli osteociti, negli osteoblasti, nei muscoli e nelle cellule all'interno del midollo osseo. Il promotore dmp1 da 8 kb aveva lo stesso pattern di espressione, ma solo una percentuale di osteoblasti e cellule del midollo osseo esprimeva la proteina, il che indica che il promotore dmp1 da 8 kb è più specifico21. Nonostante ciò, i risultati ottenuti utilizzando il promotore dmp1 da 8 kb devono essere interpretati con cautela e i profili di espressione genica devono essere eseguiti di routine utilizzando marcatori specifici degli osteociti rispetto agli osteoblasti per garantire che la popolazione ottenuta sia di purezza sufficientemente elevata.
I marcatori osteoclasti OSCAR e Dcstamp sono stati trovati in popolazioni di osteociti ematopoietici non impoveriti rispetto a quelli impoveriti, questa scoperta ha portato gli autori a concludere che i digesti ottenuti dal frazionamento della calvaria neonatale dmp1-topazio 8-kb e dalla selezione GFP sono contaminati da cellule ematopoietiche. La contaminazione con cellule ematopoietiche avrebbe potuto essere mitigata stringendo la porta di ordinamento della GFP poiché le cellule ematopoietiche GFP-positive avevano un'intensità GFP ragionevolmente inferiore rispetto alle cellule mesenchimali GFP-positive (osteociti)22.
I metodi per lo studio degli osteociti in vitro hanno contribuito alla recente ricchezza di informazioni sulla biologia degli osteociti. Tuttavia, l'isolamento degli osteociti rimane una procedura laboriosa e lunga con basse rese cellulari. Il metodo descritto di digestione ossea utilizzando collagenasi e EDTA spesso fino alla frazione 823, richiede diverse ore in cui la vitalità degli osteociti è tassata. I ricercatori hanno riferito di utilizzare frazioni (2\u20125) per l'ordinamento cellulare 20 e hanno dimostrato che il profilo di espressione dei geni associati agli osteociti rispetto a quelli degli osteoblasti conferma il successo dell'isolamento di popolazioni di osteociti puri20. In questo articolo, descriviamo il processo di ottenimento delle frazioni (2-0125) e confrontiamo la resa degli osteociti da ciascuna frazione a partire dalla frazione da 1 a 8 per determinare il ritorno degli osteociti in ogni frazione. Descriviamo anche la dissezione della calvaria di topo dmp1-topazio neonatale e la digestione calvariale usando collagenasi e acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), nonché la preparazione delle cellule per FACS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Data aquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &#956;m nylon mesh.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td>
			<td></td>
			<td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAriaTM II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore, Ireland</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>FALCON, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>40&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Wako, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &#956;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

L'osteocita, una volta ritenuto un residente passivo dell'osso data la funzione dietro le quinte di rilevare il carico meccanico, è ora portato sotto i riflettori e ha dimostrato di avere molteplici funzioni importanti come modificare attivamente la matrice extracellulare e formare un organo endocrino con il sistema lacunocanalicolare che lo racchiude inviando messaggi a siti distanti. Grazie ai metodi che hanno permesso di testare l'osteocita in vitro dall'isolamento degli osteociti primari alle linee cellulari simili agli osteociti, gli osteociti stanno ora vivendo un interesse clamoroso e un'ondata di conoscenze sulla struttura e la funzione. Molti aspetti della biologia degli osteociti e dell'interazione con altri componenti molecolari devono ancora essere scoperti. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio l'isolamento efficiente degli osteociti primari dal calvario di topo neonatale dmp1-topazio, che esprimono la proteina fluorescente verde negli osteociti, attraverso il frazionamento cellulare e successivamente l'acquisizione di colture di osteociti primari da parte di FACS.

Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare il processo di ottenimento di colture di osteociti primari dal calvario di topo neonatale dmp1-topazio attraverso un processo di frazionamento utilizzando collagenasi per degradare la matrice di collagene e EDTA per la chelazione del calcio, dopo di che le cellule vengono preparate per FACS per separare gli osteociti da altre popolazioni cellulari.
I metodi per ottenere osteociti primari dalla calvaria di topo neonatale spesso descrivono l'...

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Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Questo protocollo descrive la dissezione della calvaria di topo neonatale dmp1-topazio e l'isolamento degli osteociti che esprimono la proteina fluorescente verde attraverso la digestione e il frazionamento cellulare, oltre alla preparazione degli osteociti per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).

Ottenere osteociti primari attraverso il frazionamento calvario murino degli osteociti che esprimono GFP

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

2.0K Views.  Tohoku University Graduate School of Dentistry. Questo protocollo descrive la dissezione della calvaria di topo neonatale dmp1-topazio e l'isolamento degli osteociti che esprimono la proteina fluorescente verde attraverso la digestione e il frazionamento cellulare, oltre alla preparazione degli osteociti per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).

Video: Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Ottenere uova da Xenopus laevis Femmine

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Ricerca

Biologia

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell&#39;immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polisoma Frazionamento e analisi dei mammiferi Translatomes su scala Genome-wide

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

Applicazione di acido retinoico per ottenere colture osteocytes da principale del mouse osteoblasti

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the mitochondrial genome. MDPs have a wide variety of biological effects such as protecting neurons from apoptosis, improving metabolic markers, and protecting cells from chemotherapy. Humanin was the first MDP to be discovered and is the most studied peptide among the MDP family. The membrane receptors and downstream signaling pathways of humanin have been carefully characterized. Additional MDPs such as MOTS-c and SHLP1-6 have been more recently discovered and the signaling mechanisms have yet to be elucidated. Here we describe a cell culture based method to determine the function of these peptides. In particular, cell fractionation techniques in combination with western blotting allow for the quantitative determination of activation and translocation of important signaling molecule. While there are other methods of cell fractionation, the one described here is an easy and straightforward method. These methods can be used to further elucidate the mechanism of action of these peptides and other therapeutic agents.

This protocol describes how to stimulate cells with mitochondrial-derived peptides and assess the signaling cascade and localization of phospho-proteins.

Ottenere osteociti primari attraverso il frazionamento calvario murino degli osteociti che esprimono GFP

Riepilogo

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