Микроокнирония обеспечивает высокую сложность и динамику, включая постоянно меняющиеся цитокины, концентрацию лигандов и состав. Создание подобной культурной среды имеет решающее значение для исследований in vitro на сложных жизненных механизмах, таких как дифференциация стволовых клеток, иммунные реакции и развитие органов на чиповых платформах. Но генерировать и доставлять химические сигналы нанолитровой точности и миллисекунд трудно с помощью обычных биомедицинских подходов, таких как пипетка.
Для решения этих задач высокой востребованность представляет такие задачи, как культурная платформа, способная чередовать генерацию динамических комбинаторных и последовательных входных сигналов для получения изображений. В этом протоколе представлена процедура проектирования и изготовления микрофлюидного устройства. Предлагаемый микрофлюидный чип состоит из 1500 единиц культуры, массива усовершенствованной перистальтической насосы и на месте смешивания модуль.
Мы демонстрируем, что платформа подходит для исследований на одноклеточных двухмерных популяциях клеток и трехмерных нейронных сферах. Сложные и динамичные условия окружающей среды на чипе имеют большое влияние на дифференциацию нервных стволовых клеток и самообувяждание. Детали процедур проектирования и изготовления следующие.
Конструкция чипа была выполнена с использованием программного обеспечения AutoCAD. Чтобы соответствовать размеру держателя пластины на микроскопе, микрофлюидный чип размером примерно семь на пять сантиметров и состоит из 1500 культурных камер. Одной из важных особенностей является он имеет перистальтический насос, который состоит из восьми каналов потока и 200 микрометров в ширину каналов управления.
Увеличение перекрывающейся области между контролем и каналом потока увеличивается в 16 раз по сравнению с перистальтической насосом, предложенной Стивеном Кваке в 2002 году, примерно до 15 нанолитров жидкости и за цикл перекачки и достаточно для поддержания 1500 независимых экологических условий параллельно на чипе. Другой важной частью устройства является двухслойная культурная камера, которая может поддерживать культурную среду, свободную от стрижки. Нежелательный стресс стрижки предотвращается, направляя его быстро через верхний слой.
Клетки, ткани и важнейшие условные среды остаются нетронутыми в нижнем слое. Численное моделирование позволяет предположить, что, когда жидкости направляются через культурные камеры, слева направо. силы стрижки можно эффективно предотвратить.
Даже при скорости входного потока 10 миллиметров в секунду ткани или ткани размером с микрометр остаются нетронутыми в нижней части единицы культуры. Мы изготовили реплики литья или кремниевой пластины с использованием УФ-литографии. С помощью СУ-8 3025 получены жидкие каналы высотой 25 микрометров и весом 100 микрометров.
Культурные камеры высотой 75 микрометров и 150 микрометров были изготовлены с использованием фоторесурсов СУ-8 3075. Положительный фоторезистер аз-50X используется для объектов круглой формы, которые пересекаются с каналами управления для обеспечения хорошего соединения. Для производства микрофлюдикового чипа узорчатые и пустые кремниевые пластины сначала обработались TMCS.
Различные количества PDMS 10 к 1 мономера к катализатору соотношение было тщательно смешаны и debubbled в течение одного-двух часов в вакуумной камере при минус 0,85 мегапаскаля. Контрольный слой был получен с помощью спинового покрытия PDMS при 2 200 об/мин. Затем кремниевые пластины были перенесены в инкубатор и инкубированы в течение 60 минут при 80 по Цельсию.
Различные слои были выровнены и связаны друг с другом с помощью индивидуального оптического устройства и плазменного офорта машины. Входные отверстия были затем пробита после еще двух часов тепловой связи на 80 по Цельсию. Чип был связан с PDMS покрытие скольжения, который такой же размер 96-ну пластины и вылечить, по крайней мере 12 часов на 80 centrigrade перед использованием.
Для работы каналы управления были подключены к миниатюрным пневматическим соленоидным клапанам через пластиковые трубки. Поворот всех полуматических скважин контролировался пользовательской программой MATLAB через графический пользовательский интерфейс. Оптимальное давление закрытия мембранных клапанов PDMS определялось индивидуально для каждого чипа, который обычно колеблется от 25 до 30 PSI.
Превратив все серии скважин динамически комбинаторных и последовательных входов могут быть получены на чипе. Клетки были собраны на 80% стечения и resuspended с культурой среднего DMEM при плотности около 10 к власти шесть на миллилитр, которые затем были загружены в чип, давя на ячейку, содержащую раствор. Как для адепта, так и для культуры суспензии нейростекумных клеток были собраны клетки и сферы были непосредственно загружены в чип.
Для получения изображений использовался перевернутый микроскоп с автоматической трансляционной стадией и цифровой дополнительной полупроводниковой камерой с оксидом металла. Этап и получение изображения контролировались с помощью программного обеспечения показывает верхний левый угол и нижний правый угол камеры в качестве выбора точек и переместить трансляционную стадию в точки упорядоченно, чтобы получить предварительную визуализацию с 4x объективом цели. Измените объектив 4x объектив с 20x один и настроить параметры изображения, включая интенсивность света, время разоблачения, и так далее.
Затем найдите точки выбора, чтобы положение каждой камеры покидало матрицу 13 на 15 камер или определялась программой автоматически. При определении координат камер, трансляционная стадия перемещается в каждую камеру, где X, Y, й фокусная плоскость может быть отлажена. Установите интервал и продолжительность цикла визуализации.
Сохраните путь, а затем начните визуализацию. Эта система доступна для различных целевых динамических слежения, таких как дифференциация нервных стволовых клеток в ярком поле и поле флуоресценции процесса формирования сферы нервных стволовых клеток. анализ данных.
Измените формат в nd2 на Tif с помощью пользовательской программы MATLAB. И разделить данные в соответствии с точками. Выберите объект для анализа клеток или тканей.
Введите порог, размер объекта, размер шума для анализа. Или вы можете выбрать пошагового анализа оптимальных параметров. А потом проанализировать все данные.
После сохранения результата в формате MAT, используя сюжет, чтобы нарисовать результаты или следы. В этой статье мы описали протокол и культуру высокопротекутной микрофлюидной системы чипов, основанную на технологии фотолитографии для динамического управления микроокнороникой живых клеток. Мы также описали некоторые параметры, которые следует тщательно контролировать, такие как закрытие давления мембранных клапанов PDMS и спин-контроль жидкости параллельно камере.
В традиционной клеточной культуре in vitro обработка окружающей среды культуры клетки выполнена вручную, которая много времени и трудоемкая и заполненная жидкость не легка к стандартному управлению. Особенно минут раствора. Есть некоторые проблемы, такие как генерация входов, концентрация иммунных препаратов и большое потребление.
Однако, используя нашу микрофлюидную систему, можно повторить ее в качестве стимулятора при фиксированной дозе одной жидкости равного количества равномерной концентрации, сравнить различные культуры в разных культурных камерах одновременно. Различные с некоторыми миниатюрными временного разрешения назад стимул и с субsetting резолюции путем регулирования жидкости. Кроме того, наша система может получить большое количество сравнительных экспериментальных результатов простыми операциями.
Наша система основана на принципе диффузии, создает минимальное механическое нарушение клеточной микросреду. Для более стабильных клеточных микроокновидных чипов можно увеличить список буферного слоя как глубины культурного слоя или уменьшить входной жидкости среднего обмена, то есть снизить давление, которое будет здесь для исследования поведения клеток. Следует заметить, что это исследование изучило только культуру клеток 3T3 и NSC.
Для других ячеек или клеточных линий условия культуры сопоставимы с нашими параметрами для ее регулировки.
