البيئة الدقيقة تمكين معقدة للغاية وديناميكية بما في ذلك السيتوكينات المتغيرة باستمرار، تركيز ليغاندس وتكوينها. لخلق بيئة ثقافية مماثلة أمر بالغ الأهمية للدراسات المختبرية على أجهزة الحياة المعقدة مثل تمايز الخلايا الجذعية، والاستجابات المناعية، وتطوير الأعضاء على منصات رقاقة. ولكن لتوليد وتقديم إشارات كيميائية من حجم نانولتر ودقة مللي ثانية من الصعب استخدام النهج الطبية الحيوية التقليدية مثل pipetting.
لمواجهة التحديات، هناك منصة ثقافية قادرة على توليد صورة بديلة لمدخلات الإشارات الديناميكية المدمجة والمتعاقبة على الطلب المرتفع. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم إجراءات تصميم وتصنيع جهاز microfluidic. تتكون رقاقة microfluidic المقترحة من 1500 وحدة ثقافة ، ومجموعة من المضخات التثاقية المحسنة ومعامل الخلط في الموقع.
ونحن نثبت أن منصة مناسبة للدراسات على خلايا واحدة مجموعات الخلايا ثنائية الأبعاد والمجالات العصبية ثلاثية الأبعاد. الظروف البيئية المعقدة والديناميكية على رقاقة لها آثار كبيرة على تمايز الخلايا الجذعية العصبية والتجديد الذاتي. وفيما يلي تفاصيل إجراءات التصميم والتصنيع.
تم تنفيذ تصميم رقاقة باستخدام برنامج أوتوكاد. لتتناسب مع حجم حامل لوحة على المجهر، رقاقة microfluidic هو ما يقرب من سبعة في خمسة سنتيمترات في الحجم ويتكون من 1500 غرف الثقافة. واحدة من الميزات الهامة هو أنه يحتوي على مضخة التجذم الذي يتكون من ثماني قنوات تدفق و 200 ميكرومتر قنوات التحكم واسعة.
الزيادة في المساحة المتداخلة بين السيطرة وقناة التدفق زيادة 16 مرة بالمقارنة مع مضخة التثابر، التي اقترحها ستيفن كويك في عام 2002، إلى حوالي 15 نانولتر السائل وفي دورة الضخ ويكفي الاحتياجات للحفاظ على 1500 الظروف البيئية المستقلة بالتوازي على رقاقة. جزء مهم آخر من الجهاز هو غرفة ثقافة من طبقتين ، والتي يمكن أن تحافظ على بيئة ثقافة خالية من القص. يتم منع إجهاد القص غير المرغوب فيه عن طريق توجيهه بسرعة عبر الطبقة العليا.
الخلايا والأنسجة والمتوسطة الشرطية الحاسمة لا تزال بمنأى في الطبقة السفلية. تشير المحاكاة العددية إلى أنه عندما يتم توجيه السوائل من خلال غرف الثقافة ، من اليسار إلى اليمين. يمكن منع قوى القص بشكل فعال.
حتى في معدل تدفق المدخلات من 10 ملليمتر لكل خلية ثانية أو الأنسجة بحجم ميكرومتر لا تزال دون عائق في الجزء السفلي من وحدة الثقافة. نحن ملفقة صب النسخة المتماثلة أو رقاقة السيليكون باستخدام الطباعة الحجرية للأشعة فوق البنفسجية. يتم إنتاج القنوات السائلة من 25 ميكرومتر في الطول و 100 ميكرومتر في الوزن باستخدام SU-8 3025 مضاد ضوئي سلبي.
تم تصنيع غرف الثقافة من 75 ميكرومتر و 150 ميكرومتر في الارتفاع باستخدام SU-8 3075 فوتوريست. يستخدم جهاز قياس الصور الإيجابي AZ50X لميزات البئر المستديرة الشكل التي تتداخل مع قنوات التحكم لضمان اتصال جيد. لإنتاج رقاقة microfludic، تم التعامل مع رقائق السيليكون منقوشة وفارغة أولا مع TMCS.
تم خلط كميات مختلفة من PDMS 10 إلى 1 من نسبة مونومر إلى محفز تماما وdeubbled لمدة ساعة إلى ساعتين في غرفة فراغ في ناقص 0.85 megapascal. تم الحصول على طبقة التحكم عن طريق طلاء الدوران PDMS في 2, 200 دورة في الدقيقة. ثم تم نقل رقائق السيليكون إلى الحاضنة واحتضانها لمدة 60 دقيقة في 80 درجة مئوية.
تم محاذاة طبقات مختلفة والترابط معا باستخدام جهاز بصري مخصص وآلة حفر البلازما. ثم تعرضت ثقوب المدخل للكم بعد ساعتين أخريين من الترابط الحراري عند درجة مئوية 80. تم ربط الشريحة بقسيمة غطاء مغلفة ب PDMS ، وهي نفس حجم لوحة 96 بئرا وعالجت لمدة 12 ساعة على الأقل عند 80 درجة مئوية قبل الاستخدام.
للتشغيل، تم توصيل قنوات التحكم إلى صمامات سولينويد هوائية مصغرة من خلال أنابيب بلاستيكية. تم التحكم في تحويل جميع الآبار penumatic من قبل برنامج MATLAB مخصص من خلال واجهة المستخدم الرسومية. تم تحديد ضغوط الإغلاق المثلى لصمامات غشاء PDMS الدفعية بشكل فردي لكل رقاقة ، والتي تتراوح عادة من 25 إلى 30 PSI.
من خلال تحويل كل من سلسلة من الآبار يمكن أن تتولد ديناميكيا المدخلات combinatorial ومتتابعة على رقاقة. تم حصاد الخلايا بنسبة التقاء 80٪ وإعادة إنفاقها مع DMEM متوسط الثقافة بكثافة حوالي 10 إلى الطاقة ستة لكل ملليلتر ، والتي تم تحميلها بعد ذلك في الشريحة عن طريق الضغط على الخلية التي تحتوي على محلول. بالنسبة لكل من الخلايا الجذعية العصبية وزراعة التعليق ، تم جمع الخلايا وتم تحميل المجالات مباشرة في الشريحة.
للحصول على الصورة ، تم استخدام مجهر مقلوب مع مرحلة تحويلية تلقائية وكاميرا أشباه الموصلات الرقمية التكميلية لأكسيد المعادن. المرحلة والحصول على الصورة التي تسيطر عليها عن طريق البرنامج يظهر الزاوية اليسرى العليا وغرف الزاوية اليمنى السفلى ونقاط اختيار ونقل مرحلة الترجمة إلى نقاط منظمة للحصول على التصوير الأولي مع عدسة الهدف 4X. تغيير عدسة الهدف 4X مع واحد 20x وضبط المعلمات التصوير بما في ذلك كثافة الضوء ، وفضح الوقت ، وهلم جرا.
ثم حدد نقاط الاختيار بحيث موقف كل غرفة ترك 13 من قبل 15 مصفوفة غرفة أو أن يتم تعريفها من قبل البرنامج تلقائيا. مع تحديد إحداثيات الغرف ، تنتقل المرحلة التحويلية إلى كل غرفة حيث يمكن ضبطها بدقة X و Y و Z. تعيين الفاصل الزمني ومدة دورة التصوير.
احفظ المسار ثم ابدأ التصوير. هذا النظام متاح لتتبع ديناميكية الهدف المختلفة، مثل التمايز الخلايا الجذعية العصبية في برايتفيلد ومجال مضان من عملية تشكيل الخلايا الجذعية العصبية المجال. تحليل البيانات.
تغيير التنسيق في nd2 إلى Tif باستخدام برنامج MATLAB المخصص. وتقسيم البيانات وفقا للنقاط. حدد الكائن الذي سيتم تحليله هو الخلية أو النسيج.
أدخل العتبة وحجم الكائن وحجم الضوضاء للتحليل. أو يمكنك اختيار التحليل خطوة بخطوة إلى المعلمات المثلى. وبعد ذلك تحليل جميع البيانات.
بعد حفظ النتيجة في تنسيق MAT، باستخدام الرسم لرسم النتائج أو الآثار. في هذه الورقة ، وصفنا بروتوكول وثقافة نظام رقاقة microfluidic عالية الإنتاجية استنادا إلى تقنية التصوير الضوئي للتحكم الديناميكي في البيئة الدقيقة للخلايا الحية. كما وصفنا بعض المعلمات التي يجب على المرء التحكم فيها بعناية مثل الضغط الختامي لصمامات غشاء PDMS والتحكم في دوران السوائل بالتوازي مع الغرفة.
في الخلايا التقليدية في الثقافة المختبر يتم تنفيذ علاج بيئة ثقافة الخلية اليدوي، الذي هو مضيعة للوقت وشاقة والسوائل شغل ليس من السهل السيطرة القياسية. ولا سيما دقائق من الحل. هناك بعض المشاكل مثل توليد المدخلات، وتركيز المخدرات المناعية والاستهلاك الكبير.
ومع ذلك ، باستخدام نظامنا microfluidic ، فمن الممكن تكراره كمحفز بجرعة ثابتة من السائل الواحد كمية متساوية من التركيز الموحد ، ومقارنة الثقافات المختلفة في غرف الثقافة المختلفة في نفس الوقت. مختلفة مع بعض مصغرة دقة زمنية مرة أخرى التحفيز ومع subsetting القرار عن طريق تنظيم السائل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لنظامنا الحصول على عدد كبير من النتائج التجريبية المقارنة من خلال عمليات بسيطة.
ويستند نظامنا على مبدأ الانتشار، ويخلق الحد الأدنى من الاضطراب الميكانيكي للبيئة الدقيقة الخلوية. لرقائق البيئة الدقيقة الخلوية أكثر استقرارا يمكنك زيادة قائمة طبقة العازلة وعمق طبقة الثقافة أو تقليل السائل مدخلات التبادل المتوسط، وهذا هو الحد من الضغط، والتي سوف تكون هنا للبحث عن سلوك الخلية. ومن الملاحظ أن هذه الدراسة قد درست فقط ثقافة خلايا 3T3 و NSC.
بالنسبة للخلايا أو خطوط الخلايا الأخرى ، فإن ظروف الثقافة قابلة للمقارنة مع معلماتنا لضبطها.
