Este protocolo puede proporcionar una referencia metodológica variable para entender la estructura neurovascular complicada del mater craneal del dura en la condición fisiológica o patológica. Aprovechando el mater transparente del dura del montaje entero, la correlación espacial de las fibras de nervio immunoreactive durales de CGRP y de los vasos sanguíneos se puede demostrar en una visión 3D. Después de la eutanasia de una rata, transcardialmente la perfundió con 100 mililitros de solución salina normal al 0,9% seguida de 250 a 300 mililitros de paraformadehído al 4% en tampón molar de fosfato.
Cuando termine, retire la piel de la cabeza y abra el cráneo para exponer la duramadre y el lado dorsal del cerebro. Diseccione la duramadre craneal a lo largo del tronco encefálico hasta el bulbo olfatorio en un patrón de montaje completo. Enjuague la duramadre craneal en 0,1 tampón molar de fosfato durante aproximadamente un minuto e incubarlo en una solución de bloqueo.
Transfiera la duramadre al anticuerpo anti-CGRP de ratón durante la noche. Al día siguiente, lave la duramadre tres veces en 0,1 tampón molar de fosfato. Incubar la duramadre en una solución mixta de anticuerpo secundario anti-ratón Alexa Fluor 488 y faloidina 568 en 0.1.
Tampón molar de fosfato que contiene suero de burro 1% normal y 0,5% Tritón X-100 durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Luego, lave la duramadre tres veces en un tampón de fosfato molar 0.1, recorte los bordes y monte en portaobjetos de microscopio. Póngase los resbalones de la cubierta con glicerina al 50% antes de la observación.
Irramice toda la duramadre de montaje con un microscopio fluorescente, luego tome imágenes de las fibras nerviosas inmunorreactivas CGRP y los vasos sanguíneos marcados con faloidina en la duramadre usando un microscopio confocal. Afeite la cabeza de la rata con una maquinilla de afeitar eléctrica, luego coloque barras para los oídos romas a la rata y colóquela en el dispositivo estereotáxico. Coloque el soporte bucal y aplique ungüento oftálmico en los ojos.
Limpie el lado quirúrgico de la piel de la cabeza con etanol al 75% y haga una incisión a lo largo de la línea media del cuero cabelludo. Retire sin rodeos el periostio y los tejidos musculares lejos del cráneo usando aplicadores estériles con punta de algodón. Perfore un pequeño agujero usando un taladro de rebabas con una broca redonda de la punta en el parietal izquierdo y los huesos temporales por encima de la arteria meningeal media.
Construya un banco alrededor del agujero con cemento de silicato dental y agregue dos microlitros de fluorogold en el agujero alrededor de la arteria meníngeo media con un microsyringe de 10 microlitros. Cubra el agujero con un pequeño pedazo de esponja hemostática. Ponga un pedazo de película de parafina en el agujero y selle los bordes con cera de hueso.
Suturar la herida con hilo estéril. Mantenga a las ratas en un área cálida hasta que se hayan recuperado por completo. A continuación, devolver las ratas de nuevo a sus jaulas.
Después de siete días de supervivencia, perfunda estas ratas con solución salina normal al 0,9% seguida de paraformadehído al 4% en 0,1 tampón molar de fosfato. Diseccione el TG y el cervical de uno a cuatro DRGs, luego córtelos al grosor de 30 micrómetros en un sistema de microtomos de criostatos en la dirección sagital. Y monte las secciones en portaobjetos de vidrio recubiertos de silano.
Rodee las secciones con una pluma histoquímica e incubarlas durante 30 minutos en solución de bloqueo. Transfiera las muestras a la solución de anticuerpos anti-fluorogold de conejo y anti-CGRP de ratón e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, lave las secciones tres veces en 0.1 tampón molar de fosfato.
Incubar las secciones lavadas en una solución mixta de anticuerpo secundario anti-conejo Alexa Fluor 594 y anti-ratón de burro Alexa Fluor 488. Luego lávelos tres veces en 0.1 tampón molar de fosfato y aplique resbalones de cubierta con 50% de glicerina para la observación. Tome imágenes de las neuronas etiquetadas fluorogold en TG y DRGs bajo iluminación UV usando un microscopio fluorescente.
Luego, capture imágenes de las neuronas fluorogold y CGRP etiquetadas en TG y DRGs. Después de la coloración histoquímica inmunofluorescente y fluorescente con CGRP y el phalloidin, las fibras de nervio immunoreactive de CGRP y las arteriolas durales etiquetadas phalloidin y los tejidos conectivos fueron visualizados claramente a través del mater craneal entero del dura del montaje en un patrón 3D. Las fibras de nervio immunoreactive gruesas y finas de CGRP funcionan en paralelo a las arterias durales alrededor de la pared vascular o entre los vasos sanguíneos.
Siete días después del uso del fluorogold en la región de la arteria menínmala media y del mater craneal del dura de la rata, las neuronas etiquetadas fluorogold fueron detectadas en el TG y drgs cervical en el lado ipsolateral del uso del trazador, que fue observado directamente bajo iluminación ULTRAVIOLETA de la microscopia fluorescente. Las neuronas etiquetadas Fluorogold fueron encontradas en las tres ramas del TG, con concentraciones más altas en las divisiones oftálmicas y maxilares y con concentraciones más bajas en la división de la mandíbula. Algunas de las neuronas etiquetadas fluorogold también fueron observadas en el cervical dos a tres DRGs.
Estas fotografías representativas de inmunofluorescencias dobles muestran neuronas sensoriales en TG y DRG. Las neuronas etiquetadas con FG, CGRP, y FG y CGRP fueron visualizadas por inmunofluorescencia doble. Al intentar este protocolo, recuerde diseccionar la duramadre craneal por completo y pegarla en una diapositiva en un patrón de montaje completo.
