Este protocolo pode fornecer uma referência metodológica variável para compreender a complicada estrutura neurovascular da dura mater craniana na condição fisiológica ou patológica. Aproveitando-se de toda a montagem transparente dura mater, a correlação espacial de fibras nervosas imunoreativas dural CGRP e vasos sanguíneos pode ser demonstrada em uma visão 3D. Depois de eutanásia de um rato, transcardialmente perfundiu-o com 100 mililitros de soro fisiológico 0,9% normal seguido por 250 a 300 mililitros de 4% de paraformaldeído em 0,1 tampão molar fosfato.
Quando terminar, remova a pele da cabeça e abra o crânio para expor o lado dura e dorsal do cérebro. Disseca a dura gêmea craniana ao longo do tronco cerebral à lâmpada olfativa em um padrão de montagem inteiro. Enxágüe a dura-máter craniana em 0,1 tampão de fosfato molar por cerca de um minuto e incuba-o em uma solução de bloqueio.
Transfira o dura mater para o anticorpo anti-CGRP do mouse durante a noite. No dia seguinte, lave a dura mater três vezes em 0,1 tampão de fosfato molar. Incubar o dura mater em uma solução mista de anti-rato de burro Alexa Fluor 488 anticorpo secundário e faloidein 568 em 0.1.
Tampão fosfato molar contendo soro de burro 1% normal e 0,5% Triton X-100 por 1,5 horas em temperatura ambiente. Em seguida, lave a dura mater três vezes em tampão de fosfato molar de 0,1, corte as bordas e monte-a em slides de microscópio. Coloque os deslizamentos de cobertura com 50% de glicerina antes da observação.
Imagem toda a montagem dura mater com um microscópio fluorescente, em seguida, tirar imagens das fibras nervosas imunoreativas CGRP e vasos sanguíneos rotulados com falitina na dura mater usando um microscópio confocal. Raspe a cabeça do rato com uma navalha elétrica, depois coloque barras de ouvido cegas no rato e coloque-a no dispositivo estereotaxico. Posicione o porta-voz e aplique pomada oftálmica nos olhos.
Limpe o lado cirúrgico da pele da cabeça usando 75% de etanol e faça uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo. Remova sem rodeios e tecidos musculares do crânio usando aplicadores de algodão estéril. Faça um pequeno furo usando uma broca de rebarba com uma ponta redonda nos ossos parietal esquerdo e temporal acima da artéria meningeal média.
Construa um banco ao redor do buraco com cimento de sílica dental e adicione dois microliters de fluorogold no buraco ao redor da artéria meningeal média com uma microsiringe de 10 microliteres. Cubra o buraco com um pequeno pedaço de esponja hemostática. Coloque um pedaço de filme de parafina no buraco e sele as bordas com cera óssea.
Sutura a ferida com fio estéril. Mantenha os ratos em uma área quente até que eles se recuperem completamente. Então devolva os ratos de volta às suas gaiolas.
Após sete dias de sobrevivência, perfuse esses ratos com soro fisiológico 0,9% normal seguido de 4% de paraformaldeído em 0,1 tampão de fosfato molar. Disseca o TG e o cervical de um a quatro DRGs, em seguida, corte-os na espessura de 30 micrômetros em um sistema de microtome criostat na direção sagital. E monte as seções em lâminas de vidro revestidas de silano.
Circule as seções com uma caneta histoquímica e incuba-as por 30 minutos na solução de bloqueio. Transfira as amostras para a solução de anticorpo anti-fluorogold e camundongo e incubar a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave as seções três vezes em 0,1 tampão molar fosfato.
Incubar as seções lavadas em uma solução mista de anti-coelho de burro Alexa Fluor 594 e anti-rato de burro Alexa Fluor 488 anticorpo secundário. Em seguida, lave-os três vezes em 0,1 tampão molar fosfato e aplique deslizamentos de cobertura com 50% de glicerina para observação. Tire imagens dos neurônios rotulados fluorogold em TG e DRGs sob iluminação UV usando um microscópio fluorescente.
Em seguida, capture imagens dos neurônios rotulados fluorogold e CGRP em TG e DRGs. Após a coloração histoquímica imunofluorescente e fluorescente com CGRP e faloidina, as fibras nervosas imunoreativas CGRP e a fálice rotulada dural arterioles e tecidos conjuntivos foram claramente visualizadas em todo o monte de duração craniana mater em um padrão 3D. As fibras nervosas imunoreativas CGRP grossas e finas funcionam em paralelo às artérias durais ao redor da parede vascular ou entre os vasos sanguíneos.
Sete dias após a aplicação de fluorogold na região da artéria meningeal média e da dura-dura-rato, os neurônios rotulados fluorogold foram detectados em TG e DRGs cervicais no lado ipsilateral da aplicação do rastreador, que foi observado diretamente sob a iluminação UV da microscopia fluorescente. Os neurônios rotulados fluorogold foram encontrados nos três ramos de TG, com maiores concentrações nas divisões oftálmicas e maxilares e com menores concentrações na divisão mandibular. Alguns dos neurônios rotulados por fluorogold também foram observados nos drgs cervicais de dois a três drados.
Estas fotografias representativas de imunofluorescências duplas mostram neurônios sensoriais em TG e DRG. Os neurônios rotulados com FG, CGRP e fg e CGRP foram visualizados por dupla imunofluorescência. Ao tentar este protocolo, lembre-se de dissecar completamente a dura-fé cranial e colá-la em um slide em um padrão de montagem inteiro.
