このプロトコルは、生理学的または病理学的状態上の頭蓋硬膜の複雑な神経血管構造を理解するための可変的な方法論的参照を提供し得る。透明な全体実装デュラマーを利用して、硬膜CGRP免疫反応性神経線維および血管の容量相関を3Dビューで実証することができる。ラットを安楽死させた後、経心的に0.9%の正常な生理食塩水の100ミリリットルでそれを透過し、続いて0.1モルリン酸緩衝液に4%パラホルムアルデヒドの250〜300ミリリットルが続いた。
終了したら、頭の皮膚を取り除き、頭蓋骨を開いて脳の硬膜と後側を露出させます。脳幹に沿って頭蓋硬膜を全体のマウントパターンで嗅球に解剖する。頭蓋デュラマーターを0.1モルリン酸バッファーで約1分間リンスし、ブロッキング溶液にインキュベートします。
硬膜をマウス抗CGRP抗体に一晩移す。翌日、0.1モルリン酸緩衝液で硬膜を3回洗浄します。ロバ抗マウスアレクサFluor 488二次抗体とファロイジン568の混合溶液中で硬膜をインキュベートする。
1%正常ロバ血清および0.5%トリトンX-100を室温で1.5時間含有するリン酸モル緩衝液。次に、デュラマーターを0.1モルリン酸緩衝液で3回洗浄し、縁を整え、顕微鏡スライドに取り付けます。観察前に50%グリセリンでカバースリップを入れてください。
蛍光顕微鏡で全体のマウントデュラマーを画像化し、その後、共焦点顕微鏡を使用して、デュラマーター内のCGRP免疫反応性神経線維およびファロイジン標識血管の画像を撮ります。電気カミソリでラットの頭を剃り、ラットに鈍い耳の棒を置き、ステレオタックスデバイスに置きます。口ホルダーを置き、眼の軟膏を目に当ててください。
75%エタノールを使用してヘッドスキンの外科側をきれいにし、頭皮の正中に沿って切開を行います。無菌綿先端アプリケーターを使用して、頭蓋骨から骨膜および筋肉組織をぶっきらぼうに取り除きます。左頭頂部に丸い先端ビットを付け、中髄動脈の上側骨を用いて小さな穴を開けます。
歯科ケイ酸塩セメントで穴の周りに銀行を建設し、10マイクロシリンジで中髄動脈の周りの穴にフルオロゴールドの2マイクロリットルを追加します。小さな止血スポンジで穴を覆います。穴にパラフィンフィルムを置き、骨ワックスでエッジを密封します。
傷口を無菌糸で縫合する。ラットが完全に回復するまで、暖かい場所に保管してください。その後、ラットをケージに戻します。
7日間の生存の後、これらのラットを0.9%正常生理食塩基に浸透させ、続いて0.1モルリン酸緩衝液に4%パラホルムアルデヒドを続ける。TGと子宮頸部を1~4個のDRGを解剖し、矢状方向のクライオスタットミクロトームシステムで30マイクロメートルの厚さで切断します。そして、シランコーティングガラススライド上のセクションをマウントします。
セクションをヒストケミカルペンで囲み、ブロッキング溶液で30分間インキュベートします。サンプルをウサギの抗フルオロゴールドおよびマウス抗CGRP抗体の溶液に移し、一晩摂氏4度でインキュベートします。翌日、0.1モルリン酸緩衝液で3回セクションを洗浄します。
洗浄した部分を、ロバ抗ウサギアレクサFluor 594とロバ抗マウスアレクサFluor 488二次抗体の混合溶液にインキュベートする。その後、0.1リン酸モルバッファーで3回洗浄し、観察のために50%グリセリンでカバースリップを適用します。蛍光顕微鏡を用いて、TGおよびDRGの蛍光金標識ニューロンをUV照明下で撮影します。
次に、TGおよびDRGにおけるフルオロゴールドおよびCGRP標識ニューロンの画像をキャプチャする。CGRPおよびファロイジンによる免疫蛍光および蛍光組織化学的染色後、CGRP免疫反応性神経線維およびファロイジン標識された硬直動脈および結合組織は、3Dパターンで頭蓋デュラマー全体を通して明確に可視化された。厚くて薄いCGRP免疫反応神経線維は、血管壁の周りまたは血管間の硬膜動脈と並行して実行されます。
中髄膜動脈およびラット頭蓋硬膜の領域にフルオロゴールドを塗布してから7日後、蛍光顕微鏡のUV照射下で直接観察されたトレーサー塗布のイプシラテラ側で、フルオロゴールド標識ニューロンがTGおよび子宮頸部DRGで検出された。フルオロゴールド標識ニューロンは、TGの3つの枝すべてで発見され、眼科および上顎分裂に高い濃度があり、下顎除算部の濃度が低かった。フルオロゴールド標識ニューロンの一部は、子宮頸部2〜3個のDRGでも観察された。
これらの二重免疫蛍光の代表的な写真は、TGおよびDRGにおける感覚ニューロンを示す。FG、CGRP、およびFGおよびCGRPを用いた標識ニューロンを、二重免疫蛍光によって可視化した。このプロトコルを試みるとき、頭蓋デュラマーを完全に解剖し、全体のマウントパターンのスライドに貼り付けることを忘れないでください。
