Bu protokol, kraniyal dura mater'in fizyolojik veya patolojik durumdaki karmaşık nörovasküler yapısını anlamak için değişken bir metodolojik referans sağlayabilir. Şeffaf tüm mount dura mater'den yararlanarak, dural CGRP immünreaktif sinir liflerinin ve kan damarlarının spasiyal korelasyonu 3D görünümde gösterilebilir. Bir sıçanı ötenazi yaptıktan sonra, transkardiyal olarak 100 mililitre% 0.9 normal salin ile perfüzyon ve ardından 0.1 molar fosfat tamponunda% 4 paraformaldehitin 250 ila 300 mililitresi ile perfüzyon.
Bittiğinde, kafa derisini çıkarın ve beynin dura mater ve dorsal tarafını ortaya çıkarmak için kafatasını açın. Beyin sapı boyunca kranial dura mater'i koku ampulüne bütün bir montaj deseninde parçalara ayırın. Kranial dura mater'i 0,1 molar fosfat tamponunda yaklaşık bir dakika durulayın ve bir engelleme çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
Dura mater'i bir gecede fare anti-CGRP antikoruna aktarın. Ertesi gün, dura mater'i 0.1 molar fosfat tamponunda üç kez yıkayın. Dura mater'i eşek anti-fare Alexa Fluor 488 ikincil antikor ve 0.1'de phalloidin 568 karışık bir çözeltide kuluçkaya yatırın.
Oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca %1 normal eşek serumu ve %0,5 Triton X-100 içeren molar fosfat tamponu. Ardından, dura mater'i 0,1 molar fosfat tamponunda üç kez yıkayın, kenarları kırpın ve mikroskop slaytlarına monte edin. Gözlemden önce% 50 gliserin ile kapak kaymaları koyun.
Tüm mount dura mater'i floresan mikroskopla görüntüleyin, ardından konfokal mikroskop kullanarak dura mater'deki CGRP immünoreaktif sinir liflerinin ve phalloidin etiketli kan damarlarının görüntülerini çekin. Farenin kafasını elektrikli bir jiletle tıraş edin, sonra sıçana künt kulak çubukları koyun ve stereotaksik cihaza yerleştirin. Ağız tutucuyu yerleştirin ve gözlere oftalmik merhem uygulayın.
%75 etanol kullanarak baş derisinin cerrahi tarafını temizleyin ve kafa derisinin orta çizgisi boyunca bir kesi yapın. Steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak periosteum ve kas dokularını kafatasından açıkça çıkarın. Orta meningeal arterin üzerindeki sol parietal ve temporal kemiklerde yuvarlak uçlu bir çapak matkabı kullanarak küçük bir delik açın.
Diş silikat çimentosu ile deliğin etrafına bir banka inşa edin ve orta meningeal arter etrafındaki deliğe 10 mikrolitre mikrosihal ile iki mikrolitre florogold ekleyin. Deliği küçük bir hemostatik sünger parçasıyla kapatın. Deliğe bir parça parafin filmi koyun ve kenarları kemik balmumu ile kapatın.
Yarayı steril iplikle dikin. Sıçanları tamamen iyileşene kadar sıcak bir alanda tutun. O zaman fareleri kafeslerine geri götür.
Yedi sağkalım gününden sonra, bu sıçanları% 0.9 normal salin ile perfüzyon ve ardından 0.1 molar fosfat tamponunda% 4 paraformaldehit. TG ve servikal bir ila dört DRG'yi parçalara bölün, ardından sagittal yönde bir kriyostat mikrotom sistemi üzerinde 30 mikrometre kalınlığında kesin. Ve bölümleri silane kaplı cam slaytlara monte edin.
Bölümleri histokimyasal bir kalemle daire içine edin ve blokaj çözeltisinde 30 dakika kuluçkaya bırakın. Örnekleri tavşan anti-florogold ve fare anti-CGRP antikor çözeltisine aktarın ve bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, bölümleri 0.1 molar fosfat tamponunda üç kez yıkayın.
Yıkanmış bölümleri eşek anti-tavşan Alexa Fluor 594 ve eşek anti-fare Alexa Fluor 488 ikincil antikor karışık bir çözelti içinde kuluçkaya. Daha sonra bunları 0,1 molar fosfat tamponunda üç kez yıkayın ve gözlem için% 50 gliserin ile kapak kaymaları uygulayın. Floresan mikroskop kullanarak UV aydınlatması altında TG ve DRG'lerdeki florgöl etiketli nöronların görüntülerini çekin.
Daha sonra, TG ve DRG'lerde florogold ve CGRP etiketli nöronların görüntülerini yakalayın. CGRP ve phalloidin ile immünofluoresan ve floresan histokimyasal boyamadan sonra, CGRP immünoreaktif sinir lifleri ve phalloidin etiketli dural arteriyüller ve bağ dokuları tüm mount cranial dura mater boyunca 3D bir desende net bir şekilde görselleştirildi. Hem kalın hem de ince CGRP immünreaktif sinir lifleri, damar duvarı etrafındaki veya kan damarları arasındaki dural arteriyellere paralel olarak çalışır.
Orta meningeal arter ve sıçan kranial dura mater bölgesinde florogold uygulamasından yedi gün sonra, florgöl etiketli nöronlar, florgöl etiketli nöronlar, florgöl etiketli nöronlar, florgöllü mikroskopinin UV aydınlatması altında doğrudan gözlenen izleyici uygulamasının ipsilateral tarafında TG ve servikal DRG'lerde tespit edildi. Florogold etiketli nöronlar, oftalmik ve maksiller bölümlerde daha yüksek konsantrasyonlarda ve mandibular bölünmede daha düşük konsantrasyonlarda TG'nin üç dalında da bulundu. Florogold etiketli nöronların bir kısmı da servikal iki ila üç DRG'de gözlendi.
Bu çift immünoresans temsili fotoğraflar TG ve DRG'de duyusal nöronları göstermektedir. FG, CGRP ve hem FG hem de CGRP ile etiketlenmiş nöronlar çift immünoresans ile görselleştirildi. Bu protokolü denerken, kranial dura mater'i tamamen parçalamayı ve bütün bir montaj deseninde bir slayta yapıştırma unutmayın.
