El suministro normal de sangre a la cóclea es de vital importancia para la enfermedad de Meniere de la cóclea, especialmente para mantener el potencial coclear en interiores, que es la fuerza impulsora esencial para la transacción de células ciliadas. Esta función de la circulación sanguínea se ha asociado estrechamente con diferentes formas de pérdida auditiva. Una mejor comprensión del flujo sanguíneo coclear permitirá un manejo más eficaz de los trastornos auditivos resultantes de la disfunción del flujo sanguíneo.
Sin embargo, la medición directa del flujo sanguíneo es muy, muy difícil debido a la dificultad para evaluar el oído interno. Las técnicas para evaluar el flujo sanguíneo coclear aún están en desarrollo. Aquí demostramos uno de los métodos recientes establecidos en nuestro laboratorio de ventana muscular abierta en alojamiento con microscopio de fluorescencia de alta resolución para estrechar el flujo sanguíneo coclear en especies de animales pequeños como el ratón.
La aplicación de esta técnica con modelos de masa transgenética tiene el potencial de avanzar en la investigación para desentrañar los vínculos entre la función auditiva y la patología relacionada con el flujo sanguíneo coclear en el riesgo intravascular. Nuestros procedimientos deben llevarse a cabo con precaución. Además de la hemorragia corporal momentánea, los signos vitales del animal, incluida la presión arterial y los latidos del corazón, deben controlarse durante la cirugía.
Comience recolectando aproximadamente un milímetro de sangre en heparina mediante punción cardíaca. Centrifugar la sangre a 3000 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Retire el plasma, luego lave el pellet de células sanguíneas con un mililitro de PBS tres veces por centrifugación a 3000 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.
Etiquete las células sanguíneas con un mililitro de 20 micromolares DiO o Dil en PBS, e incubar en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave las células sanguíneas marcadas con un mililitro de PBS y centrifugar tres veces a 3000 veces G durante tres minutos. Resuspender el pellet celular en hematocrito al 30% con aproximadamente 0,9 mililitros de PBS antes de la inyección.
Prepare instrumentos quirúrgicos estériles y una plataforma de imágenes y coloque una almohadilla térmica debajo de la cortina. Monitoree el reflejo deficiente y el tono muscular general de los ratones anestesiados para verificar la profundidad de la anestesia. Coloque al animal en la almohadilla térmica caliente y su cola en el sistema de monitoreo para controlar la presión arterial y los latidos del corazón.
Mantenga la temperatura rectal a 37 grados centígrados y registre la presión arterial sistólica del animal, la presión arterial diastólica y la presión arterial media en la condición anestesiada. Abra la bulla timpánica izquierda a través de un enfoque lateral y vental bajo un microscopio estereoscópico dejando intactos la membrana timpánica y los osículos. Haga una incisión a lo largo de la línea media del cuello del animal con la cabeza inmovilizada para minimizar el movimiento.
Extirpar la glándula submandibular izquierda y el vientre posterior del músculo digástrico y cauterizar. Localice y exponga la bulla ósea identificando el músculo esternocleidomastoideo y el nervio facial que se extiende anteriormente hacia la bulla. Abra la bulla ósea con una aguja de calibre 30 y retire cuidadosamente el hueso circundante con pinzas quirúrgicas para proporcionar una visión clara de la arteria coclear y estapedial con su margen medial sobre el borde del nicho de la ventana redonda y causando la parte superior anterior hacia la ventana oval.
Use una hoja de cuchillo pequeña para raspar el hueso de la pared lateral en el ápice del medio giro de la cóclea del ratón aproximadamente a 1,25 milímetros del ápice hasta que se agriete un punto delgado. Retire las astillas de hueso con pequeños ganchos de alambre. Cubra la ventana del recipiente con un cubreobjetos cortado para preservar las condiciones fisiológicas normales y proporcione una vista óptica para grabar imágenes del recipiente.
Haga una incisión de un centímetro a lo largo de la vena safena derecha para exponer el vaso. Infundir sucesivamente 100 microlitros de cada una de la solución FITC-Dextrano y la suspensión de células sanguíneas en el animal a través de la vena safena para permitir la visualización de los vasos sanguíneos y el seguimiento del flujo sanguíneo. Observe el flujo sanguíneo en tiempo real en un monitor de video cinco minutos después de la inyección.
Imagen de los vasos sanguíneos utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de larga distancia de trabajo y una carcasa de lámpara que contiene un filtro de excitación de banda múltiple y un filtro de emisión compatible. Grabe el video utilizando una cámara de dispositivo de carga acoplada en blanco y negro digital de alta resolución que adquiere más de 350 imágenes por video. Asegurar un análisis exitoso de la velocidad del flujo.
Mida el diámetro del recipiente utilizando el software apropiado y determine la distancia entre dos puntos fijos a través del recipiente en las imágenes adquiridas. Abra el video del flujo sanguíneo en el software y configure la escala de las imágenes. Rastree las células sanguíneas teñidas con DiO seleccionadas utilizando la función de seguimiento.
A continuación, utilice la distancia a la que se han movido las celdas y el intervalo de tiempo entre fotogramas de imagen en el vídeo para el cálculo automático de la velocidad de flujo. Calcule el flujo volumétrico utilizando la ecuación dada en el manuscrito de texto. Para crear el modelo de exposición al ruido antes de registrar el flujo sanguíneo, coloque a los animales en jaulas de malla de alambre y exponerlos a ruido de banda ancha a un nivel de presión sonora de 120 decibelios en una cabina de exposición al sonido durante tres horas.
Luego, durante tres horas adicionales al día siguiente. Registre el flujo sanguíneo dos semanas después de la exposición al ruido. Después de la exposición quirúrgica de los capilares cocleares en la pared lateral, la observación microscópica de fluorescencia intravital de alta resolución de las células sanguíneas marcadas con DiL en los vasos marcados con Dextrano FITC se realizó a través de una ventana de vaso abierta.
Aquí se muestran las células sanguíneas marcadas con DiL en los vasos Stria marcados con FITC Dextran. Las células sanguíneas marcadas con FITC Dextrano muestran que la densidad de los vasos del ligamento espiral es más escasa que la de la Stria vascularis más densa. La MIV de alta resolución muestra los patrones de flujo sanguíneo en los grupos de control y expuestos al ruido.
El patrón alterado de la circulación sanguínea se puede ver en los grupos expuestos al ruido. Las anomalías incluyeron reducción del diámetro del vaso y aumento de la variación en el diámetro del vaso. Las velocidades de flujo sanguíneo en los grupos de control y exposición al ruido se calcularon mediante el seguimiento de las raíces de las células sanguíneas marcadas con DiO.
La velocidad y el volumen de la sangre en el grupo expuesto al ruido fueron significativamente más bajos que en el grupo de control. El establecimiento exitoso de la ventana de vaso abierto requiere un alto grado de habilidad quirúrgica. Se debe tener cuidado al extirpar el hueso de la pared lateral coclear.
