El presente protocolo describe una medida de detección de permeabilidad paracelular in vivo para evaluar la función de las uniones endoteliales estrechas en glándulas submandibulares de ratón. Sin embargo, la microscopía de barrido láser de dos fotones no solo tiene la ventaja de la microscopía confocal convencional, sino que también se puede usar para detectar tejidos e imágenes más profundos con mayor claridad. Este experimento proporciona una buena medida de método para evaluar la permeabilidad vascular de diferentes tejidos, especialmente los tejidos superficiales y órganos de los animales.
Comience eligiendo trazadores apropiados como fluoresceína, isotiocianato, dextrano marcado y rodamina B, marcado como dextrano con espectros de emisiones de excitación distintos, para minimizar la interferencia entre las señales de fluorescencia para el ensayo de permeabilidad. Diluir las trazas en solución salina tamponada con fosfato estéril en 100 miligramos por mililitro y almacenar las alícuotas protegidas de la luz a menos 20 grados centígrados. Después de anestesiar al ratón macho de tipo salvaje de 8 a 10 semanas de edad, sostenga suavemente la cabeza y el cuello del ratón para hacer que un lado del globo ocular sobresalga ligeramente.
Inserte una jeringa de insulina que contenga 100 microlitros de mezcla de solución trazadora fluorescente a lo largo de la esquina del ojo en ángulo recto con el ojo. Después de la inyección, coloque rápidamente el ratón sobre el cartón en posición supina con las extremidades y la cabeza pegadas con cinta adhesiva. Para el aislamiento de la glándula submandibular o SMG, bajo un microscopio estereoscópico, corte la epidermis del cuello con tijeras de tejido general para exponer ambos lados de los SMG.
Luego, use una aguja de separación de tejido romo para separar suavemente la cápsula de la superficie de la glándula sin dañar el tejido glandular, los vasos sanguíneos y la estructura glandular. Conecte el soporte personalizado al dispositivo de presión negativa y verifique si el efecto de presión negativa se logra correctamente de antemano. Coloque suavemente el SMG expuesto en el soporte personalizado y aspire el tejido mediante succión de presión negativa, lo más lejos posible del cuerpo del ratón, para reducir los artefactos de movimiento causados por la respiración y otras afecciones.
Comience a tomar imágenes poco después de que se elija el sitio de la glándula. Adquiera imágenes secuenciales a lo largo del eje Z escalonadas dos micras de distancia de la superficie de la glándula hasta 70 a 140 micras en el tejido para generar una construcción tridimensional. A continuación, adquiera imágenes de lapso de tiempo de los vasos para medir la permeabilidad vascular en el SMG.
En el cuadro de diálogo del Explorador, haga clic en Agregar nueva carpeta" y cambie el nombre del archivo. A continuación, vuelva a la columna de adquisición. En XY, el formato es de 512 por 512, y la velocidad es de 400 hercios.
Active la X bidireccional, establezca el factor de zoom en 0,75 y 1,5 para el zoom. A continuación, seleccione XYT en Modo de adquisición" para adquirir imágenes de lapso de tiempo. Establezca la duración en 20 segundos, 30 minutos o más según la necesidad experimental.
Después de establecer las condiciones, haga clic en "En vivo" para observar la imagen vascular de dos canales y canales superpuestos en el marco de formación de fotos y elegir las áreas de interés. Haga clic en Inicio" para comenzar la creación de imágenes. Ensayo de permeabilidad vascular in vivo e imágenes tridimensionales de vasos sanguíneos en ratones.
Las glándulas submandibulares se muestran aquí. En el grupo control, ambos marcadores existían en los vasos sanguíneos del SMG. Debido a su pequeño peso molecular, FD4 fue capaz de filtrarse de los vasos sanguíneos a los lados basales de acinos y conductos, representando así claramente la forma de los acinos y conductos.
El RD70 se distribuyó en vasos sanguíneos de gran tamaño y microvasos. En el grupo de ligadura de conductos, tanto FD4 como RD70 se extravasaron a los lados basales de los acinos, lo que indicó que la ligadura del conducto podría interrumpir la función de barrera endotelial y aumentar la permeabilidad a moléculas grandes. Además, los resultados semicuantitativos de intensidad de fluorescencia FD4 y RD70 confirmaron estas observaciones.
Las imágenes tridimensionales mostraron una fluorescencia mucho más oscura de FD4 y RD70 alrededor de los vasos sanguíneos en el grupo de ligadura en comparación con el grupo de control. El aislamiento cuidadoso de SMG y la colocación adecuada y el microscopio son requisitos previos esenciales para una detección exitosa. Después de los procedimientos, la tasa de flujo sanguíneo se puede calcular combinando el movimiento de los glóbulos rojos y se puede perseguir la infiltración de las células sanguíneas marcadas con fluorescencia.
