O fornecimento normal de sangue para cóclea é criticamente importante para a Doença de Cochlea Meniere, especialmente para a manutenção do potencial coclear interno, que é a força motriz essencial para a transação de células ciliares. Esta função de circulação sanguínea tem sido intimamente associada com diferentes formas de perda auditiva. Uma melhor compreensão do fluxo sanguíneo coclear permitirá um gerenciamento mais eficaz dos distúrbios auditivos resultantes da disfunção do fluxo sanguíneo.
No entanto, a medição direta do fluxo sanguíneo é muito, muito desafiadora devido à dificuldade de avaliar o ouvido interno. Técnicas para avaliar o fluxo sanguíneo coclear ainda estão em desenvolvimento. Aqui demonstramos um dos métodos recentes estabelecidos em nosso laboratório abrir janela muscular em acomodação com microscópio de fluorescência de alta resolução para reduzir o fluxo sanguíneo coclear em pequenas espécies animais, como o rato.
A aplicação dessa técnica com modelos de massa transgenética tem o potencial de avançar na pesquisa para desvendar as ligações entre a função auditiva e a patologia relacionada ao fluxo sanguíneo coclear em risco intravascular. Nossos procedimentos devem ser conduzidos com cautela. Além da hemorragia corporal momentânea, os sinais vitais do animal, incluindo pressão arterial e batimentos cardíacos, devem ser monitorados durante a cirurgia.
Comece coletando aproximadamente um milímetro de sangue na heparina por punção cardíaca. Centrifugar o sangue a 3000 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius. Remova o plasma, depois lave a pelota de célula sanguínea com um mililitro de PBS três vezes por centrifugação a 3000 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius.
Rotule as células sanguíneas com um mililitro de 20 dio micromolar ou dil em PBS, e incubar no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente. Lave as células sanguíneas rotuladas com um mililitro de PBS e centrífuga três vezes a 3000 vezes G por três minutos. Resuspend a pelota celular em 30% hematócrito com aproximadamente 0,9 mililitros de PBS antes da injeção.
Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis e plataforma de imagem e coloque uma almofada de aquecimento sob a cortina. Monitore o reflexo ruim e o tônus muscular geral dos camundongos anestesiados para verificar a profundidade da anestesia. Coloque o animal na almofada de aquecimento quente e sua cauda no sistema de monitor para monitorar a pressão arterial e os batimentos cardíacos.
Mantenha a temperatura retal a 37 graus Celsius e regissou a pressão arterial sistólica do animal, pressão arterial diastólica e pressão arterial média na condição anestesiada. Abra a bula timpânica esquerda através de uma abordagem lateral e vental sob um microscópio estéreo deixando a membrana timpânica e ossículos intactas. Faça uma incisão ao longo da linha média do pescoço do animal com a cabeça imobilizada para minimizar o movimento.
Remova a glândula sub mandibular esquerda e a barriga posterior do músculo digastric e cauterize. Localize e exponha a bula óssea identificando o músculo estenicleidomastoide e o nervo facial estendendo-se anteriormente em direção à bula. Abra a bula óssea com uma agulha de calibre 30 e remova cuidadosamente o osso circundante com pinças cirúrgicas para fornecer uma visão clara da artéria coclear e stapedial com sua margem medial sobre a borda do nicho da janela redonda e causando superior anterior em direção à janela oval.
Use uma pequena lâmina de faca para raspar o osso da parede lateral na curva média do ápice da cóclea do rato aproximadamente 1,25 milímetros do ápice até que um ponto fino seja rachado. Remova os lascas de osso com pequenos ganchos de arame. Cubra a janela do vaso com um deslizamento de tampa de corte para preservar as condições fisiológicas normais e forneça uma visão óptica para a gravação de imagens do vaso.
Faça uma incisão de um centímetro ao longo da veia safena direita para expor o vaso. Infundir sucessivamente 100 microliters cada uma das soluções FITC-Dextran e a suspensão das células sanguíneas no animal através da veia safena para permitir a visualização dos vasos sanguíneos e o rastreamento do fluxo sanguíneo. Observe o fluxo sanguíneo em tempo real em um monitor de vídeo cinco minutos após a injeção.
Imagem dos vasos sanguíneos usando um microscópio de fluorescência equipado com um objetivo de longa distância de trabalho e uma caixa de lâmpada contendo um filtro de excitação de banda múltipla e filtro de emissão compatível. Grave o vídeo usando uma câmera de dispositivo digital de alta resolução em preto e branco, adquirindo mais de 350 imagens por vídeo. Para garantir uma análise bem sucedida da velocidade de fluxo.
Meça o diâmetro da embarcação usando software apropriado e determine a distância entre dois pontos fixos através da embarcação nas imagens adquiridas. Abra o vídeo do fluxo sanguíneo no software e defina a escala das imagens. Rastreie as células sanguíneas manchadas de DiO selecionadas usando a função de rastreamento.
Em seguida, use a distância que as células moveram e o intervalo de tempo entre os quadros de imagem no vídeo para o cálculo automático da velocidade de fluxo. Calcule o fluxo volutivo usando a equação dada no manuscrito do texto. Para criar o modelo de exposição ao ruído antes da gravação do fluxo sanguíneo, coloque os animais em gaiolas de malha de arame e exponha-os ao ruído de banda larga a 120 decibéis nível de pressão sonora em uma cabine de exposição sonora por três horas.
Então, por mais três horas no dia seguinte. Registo sanguíneo duas semanas após exposição ao ruído. Após a exposição cirúrgica dos capilares cocleares na parede lateral, a observação microscópica de fluorescência intravital de alta resolução das células sanguíneas rotuladas por DiL nos vasos rotulados fitc Dextran foi realizada através de uma janela de vaso aberto.
Células sanguíneas rotuladas por DiL em vasos stria rotulados com FITC Dextran são mostrados aqui. Células sanguíneas rotuladas com FITC Dextran mostram que a densidade do vaso do ligamento espiral é mais escassa que a da mais densa Stria vascularis. IVM de alta resolução mostra os padrões de fluxo sanguíneo em grupos controlados e expostos ao ruído.
O padrão perturbado da circulação sanguínea pode ser visto nos grupos expostos ao ruído. As anomalias incluíram redução do diâmetro do vaso e aumento da variação do diâmetro do vaso. As velocidades de fluxo sanguíneo nos grupos de controle e ruído expostos foram calculadas através do rastreamento das raízes das células sanguíneas rotuladas pelo DiO.
A velocidade sanguínea e o volume no grupo exposto ao ruído foram significativamente menores do que no grupo controle. O estabelecimento bem sucedido da janela do vaso aberto requer um alto grau de habilidade cirúrgica. Deve-se ter cuidado na remoção do osso da parede lateral coclear.
