Nuestro protocolo ayudará a los investigadores a comprender los efectos fisiológicos de tres métodos diferentes de trasplante de médula ósea y cómo afectan los resultados experimentales en el entorno de la hematopoyesis clonal. El trasplante de médula ósea con radiación corporal total puede afectar negativamente a los órganos cardiovasculares y alterar la patogénesis de la enfermedad. Por lo tanto, nuestro laboratorio ha desarrollado dos métodos alternativos para minimizar o evitar posibles efectos secundarios.
Demostrando los procedimientos estarán Eunbee Park, un estudiante graduado, y Megan Evans, una becaria postdoctoral, ambos de mi laboratorio Para el blindaje del tórax y el abdomen, coloque la bandeja ajustable y el irradiador de rayos X a la distancia correcta para lograr una irradiación uniforme. Y coloque los ratones anestesiados en una placa plana invertida entre sí en decúbito supino. Asegure las patas a la placa con cinta adhesiva, y coloque el blindaje led para que el extremo inferior se alinee con el hueso xiphisternum y el extremo superior del escudo de plomo se siente cerca del timo.
Después del blindaje, coloque los ratones en el irradiador y exponga a los animales a dos fracciones grises de irradiación de 5,5 separadas por un intervalo de cuatro a 24 horas. Para el blindaje de la cabeza, pegue cuidadosamente las cuatro patas del ratón al abdomen. Coloque el ratón en un sujeción cónica y deslice el sujeción en la ranura dentro del escudo de plomo para que la cabeza y las orejas del ratón estén completamente cubiertas, dejando el resto del cuerpo del ratón expuesto a una radiación.
Después del blindaje, coloque los ratones en el irradiador y exponga a los animales a 5,5 fracciones grises de una radiación separadas por un intervalo de cuatro a 24 horas. Después de cada tratamiento de radiación, coloque los ratones anestesiados en una jaula en una estera calentada con monitoreo hasta que esté completamente recuperado. Para aislar los huesos, desinfecte la piel del ratón donante con etanol al 70% y haga una pequeña incisión transversal de la piel debajo de la caja torácica.
Sosteniendo la piel firmemente a cada lado de la incisión, desgarre en direcciones opuestas hacia la cabeza y los pies y desprenda la piel de todas las extremidades. Corte sobre los hombros y las articulaciones del codo, y use una toallita de laboratorio para eliminar los músculos y tejidos conectivos unidos de los hómenos. Dislote cuidadosamente las articulaciones entre el fémur y los huesos de la cadera.
Y use tijeras romas para cortar a lo largo de las cabezas femorales para separar las piernas. Cortar sobre la articulación de la rodilla, para separar el fémur y la tibia. Y use toallitas de laboratorio para eliminar cuidadosamente los músculos unidos y los tejidos conectivos de los huesos.
Luego tire de los huesos de ratones del mismo genotipo en tubos cónicos individuales de 50 mililitros que contienen 20 mililitros de PBS estéril helado en hielo. Para aislar las células de la médula ósea en un gabinete de clase dos de bioseguridad, use una aguja calibre 18 para hacer un pequeño agujero en la parte inferior de un microtubo estéril de 500 microlitros. Y coloque el tubo en un tubo de micro centrífuga estéril individual de 1.5 mililitros que contiene 100 microlitros de PBS estéril helado.
Cuando todos los tubos hayan sido preparados, retire el PBS del tubo que contiene los huesos aislados y transfiera los huesos a un plato estéril de cultivo celular de 100 milímetros. Use fórceps finos y tijeras pequeñas para eliminar cuidadosamente la epífisis de los extremos de cada hueso y coloque hasta seis huesos en cada tubo de 500 microlitros. Cuando todos los huesos hayan sido cortados, extraiga las células de la médula ósea por centrifugación.
Si se ha eliminado todo el contenido de médula, los huesos deben aparecer blancos y translúcidos con un pellet rojo relativamente grande en la parte inferior del tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Para el trasplante de células de médula ósea, diluya las células aisladas de médula ósea en medios RPMI sin suero y cargue 200 microlitros de la suspensión celular en una jeringa de insulina de 0,5 mililitros por ratón que se va a inyectar. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal, inyecte lentamente todo el volumen de células en la vena orbital retro de cada animal receptor anestesiado.
Luego coloque una gota de proparacaína en el ojo para aliviar el dolor. Y permita que el ratón recupere la conciencia mientras es monitoreado. Comparar el efecto de tres métodos de preacondicionamiento de BMT sobre el injerto de células donantes.
Las fracciones de células dispensadoras de aceite en sangre periférica y tejido del corazón eran analizadas por cytometry de flujo en un poste BMT del mes. En este análisis representativo, en la sangre periférica de los ratones receptores que recibieron irradiación de cuerpo entero, los monocitos, los neutrófilos y las células B fueron en gran parte ablacionados y reemplazados por la progenie de las células derivadas de la médula ósea donante. Además, las poblaciones cardiacas receptoras residentes del monocito y del neutrófilo fueron substituidas casi totalmente por las células derivadas dispensadoras de aceite.
En el grupo parcialmente blindado de la irradiación, el reemplazo cardiaco derivado donante de la célula inmune cardiaca era modesto. Las células receptoras de médula ósea de ratón dentro de las regiones blindadas probablemente contribuyeron al nivel más bajo de reconstitución de la sangre periférica en comparación con los ratones que recibieron irradiación corporal total. En el grupo sin el preacondicionamiento de BMT, las células derivadas dispensadoras de aceite eran perceptibles en la sangre periférica y los corazones de ratones receptores en cuatro semanas de poste BMT.
Además, las células donantes deficientes en Tet2 se expandieron gradualmente con el tiempo. En comparación, los ratones receptores injertados con células donantes de tipo salvaje mostraron una expansión clonal mínima de las células donantes. La optimización de estos modelos experimentales permitirá realizar estudios más rigurosos de los genes impulsores de la hematopoyesis clonal que contribuyen a la mortalidad por todas las causas, como las enfermedades cardio-metabólicas y el cáncer.
Esperamos que nuestros protocolos permitan a los investigadores estudiar la hematopoyesis clonal para investigar cómo contribuye a la enfermedad cardiovascular y otros estados de la enfermedad.
