Nosso protocolo ajudará os pesquisadores a entender os efeitos fisiológicos de três diferentes métodos de transplante de medula óssea e como eles afetam os resultados experimentais na configuração da hematopoiese clonal. O transplante total de radiação corporal de medula óssea pode impactar negativamente órgãos cardiovasculares e alterar a patogênese da doença. Assim, nosso laboratório desenvolveu dois métodos alternativos para minimizar ou evitar possíveis efeitos colaterais.
Demonstrando os procedimentos estarão Eunbee Park uma estudante de pós-graduação, e Megan Evans uma bolsista de pós-doutorado, tanto do meu laboratório para blindagem do tórax e abdômen, coloque a bandeja ajustável e o irradiador de raios-X na distância correta para alcançar a irradiação uniforme. E coloquem os ratos anestesiados em uma placa de led plana invertida umas com as outras na posição supina. Fixar as patas na placa com fita adesiva, e coloque a blindagem de led para que a extremidade inferior se alinhe com o osso xiphisternum e a extremidade superior do escudo de chumbo fique perto do timo.
Após a blindagem, coloque os camundongos no irradiador e exponha os animais a duas frações cinzentas de irradiação separadas por um intervalo de quatro a 24 horas. Para blindagem da cabeça, corte cuidadosamente as quatro patas do rato no abdômen. Coloque o mouse em um contidor cônico e deslize o conterrâneo para dentro do slot dentro do escudo de chumbo para que a cabeça e as orelhas do mouse estejam completamente cobertas, deixando o resto do corpo do rato exposto para uma radiação.
Após a blindagem, coloque os ratos no irradiador e exponha os animais a, a 5,5 frações cinzas de uma radiação separada por um intervalo de quatro a 24 horas. Após cada tratamento de radiação, coloque os camundongos anestesiados em uma gaiola em um tapete aquecido com monitoramento até que esteja totalmente recuperado. Para isolar os ossos, desinfetar a pele do rato doador com 70% de etanol e fazer uma pequena incisão transversal da pele abaixo da caixa torácica.
Segurando a pele firmemente em ambos os lados da incisão, rasgue em direções opostas em direção à cabeça e aos pés e retire a pele de todos os membros. Corte sobre os ombros e articulações do cotovelo, e use uma limpeza de laboratório para remover os músculos ligados e tecidos conjuntivos do úmero. Desloque cuidadosamente as articulações entre os ossos do fêmur e do quadril.
E use uma tesoura sem cortes para cortar ao longo das cabeças femorais para desprender as pernas. Corte sobre a articulação do joelho, para separar o fêmur e a tíbia. E use lenços de laboratório para remover cuidadosamente os músculos ligados e tecidos conjuntivos dos ossos.
Em seguida, puxe os ossos de camundongos do mesmo genótipo em tubos cônicos individuais de 50 mililitros contendo 20 mililitros de PBS estéreis gelados no gelo. Para isolar as células da medula óssea em um armário de classe de biosegurança dois, use uma agulha de calibre 18 para fazer um pequeno buraco na parte inferior de um micro tubo estéril de 500 microliter. E coloque o tubo em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros estéril individual contendo 100 microliters de PBS estéril gelado.
Quando todos os tubos tiverem sido preparados, remova o PBS do tubo contendo os ossos isolados e transfira os ossos para um prato de cultura celular estéril de 100 milímetros. Use fórceps finos e pequenas tesouras para remover cuidadosamente a epífise das extremidades de cada osso, e coloque até seis ossos em cada tubo de 500 microliter. Quando todos os ossos tiverem sido cortados, extraia as células da medula óssea por centrifugação.
Se todo o conteúdo da medula tiver sido removido, os ossos devem parecer brancos e translúcidos com uma pelota vermelha relativamente grande na parte inferior do tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro. Para transplante de células de medula óssea, diluir as células isoladas de medula óssea em mídia RPMI livre de soro, e carregar 200 microliters da suspensão celular em uma seringa de insulina de 0,5 mililitro por rato a ser injetado. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, injete lentamente todo o volume de células na veia orbital retrô de cada animal receptor anestesiado.
Em seguida, coloque uma gota de proparacaína no olho para alívio da dor. E permitir que o rato recupere a consciência enquanto é monitorado. Para comparar o efeito de três métodos de pré-condicionamento de BMT no enxerto celular doador.
As frações de células doadoras no sangue periférico e tecido cardíaco foram analisadas por citometria de fluxo em um mês após o TMO. Nesta análise representativa, no sangue periférico de camundongos receptores que receberam irradiação corporal total, monócitos, neutrófilos e células B foram largamente ablados e substituídos pela prole das células derivadas da medula óssea doadoras. Além disso, as populações de moncito cardíaco e neutrófilo receptores residentes foram quase completamente substituídas por células derivadas de doadores.
No grupo de irradiação parcialmente blindado, a substituição de células imunes cardíacas derivadas do doador foi modesta. As células de medula óssea do camundongo receptor dentro das regiões protegidas provavelmente contribuíram para o menor nível de reconstituição do sangue periférico em comparação com camundongos que receberam irradiação corporal total. No grupo sem pré-condicionamento de BMT, as células derivadas de doadores foram detectáveis no sangue periférico e nos corações dos camundongos receptores a quatro semanas após o BMT.
Além disso, as células doadoras deficientes do Tet2 expandiram-se gradualmente ao longo do tempo. Em comparação, camundongos receptores engrafados com células doadoras do tipo selvagem apresentaram expansão clonal mínima de células doadoras. A otimização desses modelos experimentais permitirá estudos mais rigorosos dos genes condutores de hematopoiese clonal que contribuem para todas as causas de mortalidade, como doença cardio-metabólica e câncer.
Esperamos que nossos protocolos permitam aos pesquisadores estudar hematopoiese clonal para investigar como ela contribui para doenças cardiovasculares e outros estados de doenças.
