Nuestro protocolo permite a los investigadores estudiar el proceso de formación de la red de vasos de una manera clara y fácilmente rastreable, abriendo las puertas a nuevos estudios y arrojando luz sobre el comportamiento de los vasos sanguíneos. Esta técnica presenta la posibilidad de crear redes vasculares altamente organizadas y repetibles con respuesta al entorno circundante. Las células endoteliales de pacientes que sufren de una enfermedad vascular se pueden recuperar en el uso de este sistema, lo que permite recrear la enfermedad vascular y encontrar un tratamiento adecuado.
El método propuesto se puede ampliar para estudiar el comportamiento de la red vascular cuando se combina con diferentes tipos de células, lo que permite observar la interacción de los vasos en desarrollo con un tipo de tejido específico. Comience sumergiendo los andamios en etanol al 70% durante un mínimo de 15 minutos, luego lávelos dos veces en PBS. Mezclar 1,5 microlitros de solución común de fibronectina con 28,5 microlitros de PBS por andamio a sembrar.
Prepare una dilución de fibronectina que se utilizará para todos los andamios para evitar errores de pipeteo. Coloque los andamios escasamente encima de una superficie hidrofóbica y cubra cada andamio con 30 microlitros de la dilución de fibronectina. Reemplace la tapa de la placa y coloque los andamios cubiertos de fibronectina en una incubadora a 37 grados Celsius y 100% de humedad durante un mínimo de una hora.
Después de la incubación, enjuague ligeramente los andamios en PBS para eliminar los restos de fibronectina. Los andamios se pueden mantener en PBS a cuatro grados centígrados durante un hasta una semana. Prepare la célula endotelial o el medio de la EC mezclando el medio básico con los componentes correspondientes del kit del medio, incluyendo una solución antibiótico, FBS, y suplementos endoteliales del crecimiento de la célula según lo indicado por el fabricante.
Hacer la suspensión de células endoteliales microvasculares adiposas humanas en medio CE con una concentración de cuatro millones de células por mililitro. Usando las medidas de suba, coloque un andamio recubierto de fibronectina por pocillo en una placa de 24 pocillos que no sea TC. Cubra cada andamio con 25 gotas de microlitro de la suspensión de la celda, asegurándose de no dejar que la suspensión fluya lejos del andamio.
Coloque la tapa en el plato y colóquele en una incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 100% de humedad durante 60 a 90 minutos. Después de la incubación, llene cada pocillo con 700 microlitros de medio EC. Incubar los andamios endotelializados hasta que se pueda observar la confluencia de la CE mediante microscopía fluorescente o durante tres días.
Cambie el medio cada dos días. Prepare el medio DPSC mezclando 500 mililitros de DMEM bajo en glucosa, 57,5 mililitros de FBS, 5,75 mililitros de aminoácidos no esenciales, 5,75 mililitros de GlutaMAX y 5,75 mililitros de solución de penicilina-estreptomicina-nistatina. Transfiera los andamios endotelializados a una nueva placa de 24 pozos que no sea TC.
Deseche todos los medios de la placa actual utilizando una pipeta o succión al vacío, teniendo cuidado de no aplicar vacío directamente al andamio. Coloque un andamio en el centro de cada pozo, luego seque el área circundante con vacío ligero. Diluya las soluciones de la trombina y del fibrinógeno común con PBS a una concentración final de cinco unidades por mililitro y de 15 miligramos por mililitro respectivamente.
Prepare una suspensión de ocho millones de DPSC por mililitro en la dilución de trombina y distribuya 12,5 microlitros de la suspensión en microtubos individuales por andamio a sembrar. Establezca una pipeta de cinco a 50 microlitros en 12.5 microlitros y llénela con una solución de fibrinógeno. Sin quitar la punta, fije la pipeta en 25 microlitros.
El material en la punta debe elevarse y dejar un volumen vacío. Presione lentamente el botón del émbolo hasta que el líquido llegue a la abertura de la punta, pero no se filtre. Sostenga el émbolo en esta posición y coloque la punta en uno de los tubos de microcentrífuga que contienen las células en suspensión de trombina, asegurándose de que la punta esté en contacto con el líquido.
Suelte suavemente el botón del émbolo y dibuje la suspensión de la celda en la punta. Mezcle a fondo ambos materiales, evitando la formación de burbujas. Dispense rápidamente los materiales mezclados en la parte superior de un andamio endotelializado.
Repita los pasos anteriores para cada andamio, asegurándose de cambiar las puntas entre usos para evitar la formación inesperada de gel de fibrina dentro de la punta. Reemplace la tapa de la placa e incube los andamios a 37 grados Centígrados, 5% de dióxido de carbono y 100% de humedad durante 30 minutos. Después de la incubación, llene cada pocillo con un mililitro de DPSC uno a uno y medio EC.
Cultura durante una semana, cambiando el medio cada dos días. En diferentes momentos durante el cultivo, retirar el medio del pozo e imagen de las construcciones utilizando un microscopio confocal para estudiar el desarrollo vascular o cualquier otro parámetro de interés. Este protocolo permite la fabricación de andamios teselados hechos de fotorresistible SU-8.
Se obtuvieron andamios con geometrías compartimentales distintas y características altamente precisas y repetibles. Con la siembra simultánea tradicional de células endoteliales y células de apoyo, las células se distribuyeron homogéneamente sobre el andamio, lo que resultó en redes vasculares impredecibles y desorganizadas. Por el contrario, la siembra de células escalonadas dio lugar a redes vasculares altamente organizadas.
Cuando se utilizan células endoteliales fluorescentes, los vasos se pueden fotograr en tiempo real. La proteína fluorescente roja que expresaba las células endoteliales fue cultivada en andamios hexagonales e imagenizada. Las células de soporte se añadieron al primer día y las redes vasculares se fotogenaron cada dos días para cuantificar el desarrollo de los vasos.
Para cada punto de tiempo, se tomaron imágenes amplias de todo el andamio. El crecimiento del buque se cuantificó como la longitud total y el área del buque. Un time-lapse confocal de la proyección de imagen fue realizado para permitir el solo seguimiento del recipiente usando las células endoteliales multicolores.
La trayectoria del buque se generó a partir del lapso de tiempo, lo que permite observar la migración del buque. La maduración del recipiente fue observada por la presencia de células de la actinilla y de la ayuda del músculo liso. Para los compartimentos circular, hexagonal y cuadrado, las celdas se multiplican y se organizan en estructuras.
Por el día siete, todas las formas mostraron una red vascular rica y compleja. Imágenes de mayor aumento revelaron una presencia más densa de la célula de la actinia y de la ayuda del músculo liso co-localizada con los recipientes formados, evidenciando el reclutamiento y la diferenciación de la célula de la ayuda que rodeaban las estructuras vasculares. Esta técnica se puede utilizar para estudiar el comportamiento de las redes vasculares tridimensionales cuando se expone a diferentes condiciones, como inhibidores celulares específicos o en presencia de tipos de células adicionales.
