El autor agradece a la Dra. Gao Jin para la síntesis de PGS, el Dr. Peter Crapo para el debate profundo de biorreactor de configuración, los Dres. Mohamed Ezzelarab y Wei Wu de explante babuino arterias carótidas. Este estudio fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (R01 HL089658).

1. Andamio tubular de fabricación <ol><li> Preparar un tubo de vidrio (longitud = 70 mm, diámetro externo = 9,0 mm, espesor de pared = 1,0 mm, piezas pequeñas, Miramar, FL) como molde para andamio. </li><li> Prepare 1,0 wt / vol% de ácido hialurónico (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) mediante la disolución de 100 mg de HA en 10 ml de agua destilada. Mezclar con un rotor de la noche hasta que no queden burbujas de aire en la solución. </li><li> Vierta 1,0% solución de alta en la parte superior del tubo de vidrio. Deja que fluya lentamente a lo largo de la pared interior del molde. Dé la vuelta a la tubería cuando la solución alcanza el fondo del molde con el rotador y repetir este paso hasta que la pared interior del molde es uniformemente recubiertos por la solución. </li><li> Después del recubrimiento, en seco todos los tubos de vidrio en el horno al vacío a 37 ° C durante 24 h. </li><li> Molienda y las partículas de sal tamiz (size = 25-32 micras), utilizado como porogens. </li><li> Montar un tubo de vidrio (en el interior recubierto con HA 1,0% solución), el mandril (de acero inoxidable recubierto por un tubo de PTFE), termorretráctiles manga (SA), y el anillo de PTFE como se describió anteriormente 8. </li><li> Añadir las partículas de sal del tamaño deseado para el molde de vidrio con una espátula a través del embudo de caucho de silicona. Toque en el molde con cuidado para garantizar una distribución uniforme de partículas de sal. Raspar las partículas de sal en exceso en la parte superior del molde con el lado de la espátula. </li><li> A su vez en la hibridación incubadora durante 30 minutos antes de transferir el molde lleno de sal. Apague la hibridación incubadora y poner la sal llena de moho en la hibridación incubadora para la fusión de la sal. </li><li> Retire los moldes de la hibridación incubadora y secarlos en el horno de vacío a 37 ° C durante 24 h. </li><li> Retire el molde lleno de sal de la estufa de vacío y permita que se enfríen a temperatura ambiente. Retire el mandril de acero inoxidable, presionando hacia abajo con la celebración del anillo de PTFE. Si el mandril es demasiado estrecho para el molde, utilice el alicates para tirar de él hacia fuera. Retire el anillo de PTFE desde el fondo del molde. </li><li> Ponga el molde en el horno a 120 ° C durante 5 minutos para reducir la manga SA. Comprobar si la manga del SA, se está reduciendo. Retire la funda del SA de los moldes lleno de sal y deje que se enfríen a temperatura ambiente. Mantener los moldes en el desecador hasta su utilización. </li><li> Prepare la solución de PGS mediante la disolución de 3 g de la DGP en 15 ml de tetrahidrofurano (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para formar un peso de 20 / solución vol%. </li><li> Añadir la solución de PGS a la luz de la sal lleno de moldes dejándolo caer con un spoid en la campana de Hume. Incline el molde de vidrio de unos 45 ° y dejar la solución de PGS en la cavidad interna con rotación del molde lentamente. Compruebe si la solución PGS fluye hacia abajo a lo largo de la pared del molde. Si la mancha seca se observa, añadir más solución. </li><li> Después de añadir la solución de PGS, coloque los moldes en la campana de Hume por lo menos durante 30 minutos para evaporar THF. </li><li> Ponga el molde en el horno de vacío para el tiempo de curado pre-determinado (por ejemplo, 24 / 36 / 48 h) a 100 mTorr y 150 ° C para curar PGS. </li><li> Después de curar, sacar los moldes y ponerlos a la temperatura ambiente se enfríe. Sumerja cada molde en el agua destilada con la posición vertical lentamente. No sumerja ellos en el ayuno de agua debido a las burbujas de aire pueden causar desgarro del andamio. </li><li> La transferencia de los moldes para el baño de agua con cuidado y colocarlos en un ángulo de 1 h con tubo de silicona para disolver HA fácilmente. Compruebe si HA se disuelve en el molde. Si no se libera HA del molde, empuje el extremo del andamio lentamente con una espátula para que la liberación del molde. Repita este paso en el otro extremo del andamio y sacudir el molde de un lado a otro lentamente en el baño de agua. Revise si el andamio se mueve dentro del molde. </li><li> Transferir el andamio a otro baño de agua con un agitador con cuidado. No tomar el andamio con firmeza, lo que podría romper el andamio. Coloque el armazón en el baño de agua durante al menos 3 días con el cambio de agua para lixiviar las partículas de sal. </li><li> Después de la lixiviación de las partículas de sal, la transferencia de cada uno de andamios para el tubo de centrífuga de 15 ml llena de agua destilada y colocarlos en la caja de hielo seco durante 1 h para congelar. Poner tubos de centrífuga en el liofilizador (todas las cabinas del tubo debe estar abierto) y liofilizar ellos por 2 días. </li><li> Ponga todos los andamios en el desecador antes hasta su utilización. </li></ol> 2. Andamio Preparación para la siembra de células <ol><li> Saque de andamios en el desecador y se cortan en un 25-30mm de longitud. </li><li> Prepare dos tapones de goma de silicona (diámetro = 20 mm, espesor de pared = 6,35 mm, diámetro medio = 3 mm) y conectar dos tubos de PTFE (diámetro externo = 3,97 mm, diámetro interior = 2,38 mm, espesor de pared = 0,79 mm, longitud = 60 mm y 40 mm) a través de los orificios de centro de cada tapón. </li><li> Cortar un anillo de SA como de 1,5 mm de longitud y lo puso en la cima de uno de los extremos del andamio. Impulsar un tubo de PTFE (conectado tapón de goma de silicona) en el extremo de un andamio en pequeña parte se superponen como sea posible. </li><li> Coloque el tubo de andamio y PTFE en el horno a 120 ° C durante 10 minutos para reducir el tamaño del anillo SA. Comprobar si el anillo SA es reducido y los andamios están conectados a un tubo de PTFE con firmeza. </li><li> Saque el tubo de andamio y PTFE y ponerlos a la temperatura ambiente se enfríe. Monte el conjunto de tubos de andamio-PTFE en el tubo de policarbonato (diámetro externo = 15,5 mm, diámetro interior = 9 mm, longitud = 50 mm), como una cámara de biorreactor. </li><li> Conecte el otro extremo del tubo de PTFE al patíbulo como pasos 2.3) y 2.4). </li><li> Ajustar dos tapones de goma de silicona para fijar sus superficies interiores de los dos extremos del tubo de policarbonato. Coloque las dos superficies exteriores de los tapones de goma de silicona para dos placas de aleación de aluminio (superior e inferior, ancho = 20 mm, longitud = 70 mm, espesor = 6,35 mm). Poner dos varillas roscadas en el orificio lateral de la placa y fijar el tubo de policarbonato (incluido el interior de andamios) a las placas apretando la tuerca de tornillo en la placa. </li><li> Medir la longitud de cada seedable andamio (una longitud de entre dos anillos SA) y calcular el área de la superficie interna (π x diámetro interno x longitud seedable) de cada andamio para la siembra de células. </li><li> Envuelva un biorreactor unidad de cámara con papel de aluminio y esterilizar en autoclave a 120 ° C durante 30 min. Esterilizar a cada parte (depósito medio, tubo de la bomba, intercambiador de gas, colectores, y la válvula de aguja) del biorreactor en autoclave a 120 ° C durante 30 minutos y ensamblarlas dentro de la campana de cultivos celulares. </li><li> Pre-tratar y aclarar los andamios con una serie de infusiones (70, 50, y 25% de etanol durante 1 h, tampón fosfato salino (PBS; Mediatech, Herndon, VA) durante 2 horas y media SMC cultivo durante 24 h mediante el uso de una bomba peristáltica a 1,0 ml / min en el circuito de flujo. </li></ol> 3. La siembra de células y Cultura <ol><li> Aislar las células primarias del músculo liso arterial (SMC) de las arterias carótidas de menores babuinos machos (Papio anubis) y caracterizarlos en dos dimensiones (2D) la cultura antes de pases y la siembra, como se describió anteriormente 9. </li><li> Ampliar las CML con el MCDB 131 medianas (Mediatech, Herndon, VA) con un 10% de suero fetal bovino (Lonza, Walkersville, MD), 1% de L-glutamina (Mediatech), 50 mg / ml de ácido ascórbico (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), y una solución de antibiótico-antimicótico (10.000 UI / ml de penicilina, 10000 mg / ml de estreptomicina y 25 mg / ml de anfotericina B; Mediatech). </li><li> Separe cada cámara biorreactor desde el circuito de flujo en el biorreactor. SMC semillas (paso 4-6) al cadalso con una densidad de 2x10 6 células / cm 2 mediante la inyección de la suspensión con una jeringa de 5 ml en la luz de los andamios después de cortar dos abluminal (entrada) y los flujos de luminal (salida). </li><li> Ponga todas las cámaras de biorreactor en la hibridación incubadora a 37 ° C y girarlas a 2 rpm durante 4 horas para permitir que las células se repartirán uniformemente en el andamio. </li><li> Saque cámaras biorreactor de la hibridación incubadora de volver a conectar a flujo de circuito del biorreactor en el capó. La transferencia de todo el sistema de biorreactores en cultivo celular incubadora. </li><li> Conecte el tubo de la bomba (diámetro interno = 1,6 mm) en el cartílago de la bomba peristáltica y la carga de medio de cultivo fresco en el depósito. Iniciar la perfusión a través de la pared (luminal de abluminal) a 1,0 ml / min durante 15 minutos seguido por el flujo luminal solamente. </li><li> Aumentar el caudal y la presión poco a poco a partir de 1,0 ml / min (estrés luminal de corte: 1,1 dinas / cm 2) y 20 mmHg en el día de 1 a 14,2 ml / min (15,3 dinas / cm 2) y 120 mmHg en el día 21, respectivamente. Cambiar el tubo de la bomba (diámetro interno = 3,2 mm) en el día 4 y el medio de una vez por semana. </li></ol> 4. Tejido de cosecha y preparación de muestras para el análisis <ol><li> Después de 21 días de la cultura, la parada de la bomba y los tubos de sujeción (entrada y salida) del yacimiento medio. Separe el tubo de la bomba del cartílago de la bomba peristáltica y un sistema de biorreactor de transferencia en el capó. </li><li> Abrazadera de entrada y salida de tubos de cada cámara de bioreactor y sáquelo del circuito de flujo. Abra el tubo de entrada y preparar un plato de Petri-en la tubería de salida para recoger el medio de cultivo en el interior del tubo de policarbonato. Abrir el tubo de salida lentamente y se elimina el medio de la cámara. </li><li> Separe aguja abluminal y tubo de silicona luminal de la cámara y retire las placas de aluminio por la liberación de tornillos. Retire el tubo de policarbonato y separar uno de los extremos del tejido construcción de la tubería de PTFE. </li><li> Preparar un petri plato lleno con 10 ml de PBS y separar al otro lado de la construcción de la tubería de PTFE. Ponga en la construcción de la PBS y enjuáguese la boca tres veces. </li><li> Cortar la construcción con una cuchilla de afeitar como de 5 mm de longitud. Congelarlo a -80 ° C congelador para análisis bioquímico o transferirla a 15 ml tubo de centrífuga llena con 5 ml de medio fresco para ensayos mecánicos o congelamiento rápido en el Tissue-Tek compuesto óptimo de temperatura de corte (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA ) para el estudio histológico / inmunofluorescenciatinción orescence. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Los andamios tubulares PGS fueron fabricados utilizando elastómeros biodegradables por el método de la sal de fusión (Fig. 1A). Cada cámara biorreactor siempre andamios con los flujos tanto luminal y abluminal y podría ser separada como una unidad separada de un circuito de corriente principal (Fig. 1B). Biorreactor sistema fue diseñado para el cultivo de cuatro andamios a la vez, controlar y supervisar el flujo, así como la presión (Fig. 1C y D). Esquemática de la cultura biorreactor se muestra en la figura. 2. Después de la siembra SMC, cada cámara biorreactor fue girado a 37 ° C durante 4 horas para distribuir uniformemente las células en el lumen del andamio. Y entonces, el flujo pulsátil se aplicó a los andamios hasta el día 14 con el caudal aumenta gradualmente (Fig. 2A) y presión (Fig. 2B). Después de 14 días, el flujo y la presión se mantiene constante hasta el final de la cultura (día 21). Morfología de la superficie del andamio PGS fue examinado por microscopía electrónica de barrido (SEM). Micrografías electrónicas de barrido mostró que el andamio había pared grosor consistente (539 ± 18 micras) (Fig. 3A) y distribuidas al azar de macro y micro-poros en la superficie luminal (Fig. 3B). Parámetros morfométricos del andamio se midió desde microcomputed tomografía computarizada (micro-CT) y análisis de imágenes. Tamaño de poro promedio es de 23,3 ± 3,9 micras y la interconectividad de los poros es del 99,4 ± 0,62%, lo que significa que todos los poros están totalmente interconectados en andamios. La porosidad medida por el desplazamiento de etanol es de 75,6 ± 2,7%. Morfología de las células de la construcción de PGS fue examinada por SEM (Fig. 4). SMC completamente cubierta de varias capas de la superficie luminal y fueron orientadas perpendicularmente a la dirección del flujo. Estos resultados muestran que el condicionamiento mecánico de biorreactor de flujo pulsátil compatible con la orientación de SMC en el andamio. La presencia de la matriz extracelular (MEC) y las fibras elásticas fueron examinadas por tinción H &amp; E y la elastina autofluorescencia (Fig. 5). Tinción H &amp; E demostrado que las células y las proteínas ECM completamente cubierto de la luz del PGS construir. Elastina autofluorescencia también mostró circunferencialmente organizado fibras elásticas en la superficie luminal de la construcción. Producción de proteínas ECM en los constructores de PGS fueron medidos a partir de los análisis bioquímicos. La elastina insoluble y el contenido de colágeno fueron 20,2 ± 9,1 mg / mg de tejido y 6,3 ± 1,9 mg / mg de tejido, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Andamio de fabricación y sistema de biorreactores. (A) Esquema de andamio tubular de fabricación. (B) la cámara de biorreactor. Los andamios se conecta a un tubo de PTFE, se coloca en el tubo de policarbonato, y se fija con tapones de goma de silicona y las placas de aleación de aluminio. Cada cámara tiene dos vías de flujo: flujo luminal (por tubo de silicona) y abluminal (por aguja). (C) biorreactor sistema que dentro de la incubadora. Incluye depósito de medio módulo de la bomba peristáltica, el intercambiador de gas, transductores de presión, dos colectores (superior e inferior), y la válvula de aguja. (D) sistema de biorreactor de colocarse fuera de la incubadora. Incluye monitor de la presión, la unidad de control de flujo, sistema de adquisición de datos, y el ordenador. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Esquema de la cultura biorreactor. (A) protocolo de cultivo. (B) aplicado perfiles de presión en cada momento (día 1, 4, 7 y 14). <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Morfología superficial del andamio PGS. (A) Sección transversal. (B) Lumen. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Morfología celular de la construcción de PGS. (A) Lumen. (B) Sección de corte de 45 °. Las flechas en ambas cifras representan la dirección del flujo. <img src="/files/ftp_upload/2691/2691fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Histología y elastina autofluorescencia de los PGS construir. (A) H &amp; E tinción. (B) autofluorescencia elastina correspondiente. L: lumen. Aumentos: 40X. Barra de escala: 50 micras.

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La técnica de fabricación con un elastómero biodegradable descrito aquí tiene varias características. (1) Utilizamos el ácido hialurónico (HA) como una liberación del molde. Desde HA es soluble en agua, andamios fue liberado fácilmente de los moldes de vidrio después de la inmersión en agua. En este informe, se utilizaron 1,0 wt / vol% de solución de alta ya que la concentración baja (&lt;0.5 wt / vol%) de la solución no es viscosa y fluye hacia abajo tan rápido cuando se vierte en la parte superior del tubo de vidrio. A la solución de capa de HA de manera uniforme, que se volcó el tubo de vidrio cuando la solución voló la parte inferior de la tubería y se repite este paso. Este recubrimiento de HA es una crítica a nuestro procedimiento de fabricación de andamios para la liberación de final. (2) Se utilizó termorretráctil (SA) de manga para retener las sales en el tubo de vidrio. Ya que las sales se densamente poblado en el espacio entre la pared interior del tubo de vidrio y la manga del SA, manga SA mantiene sales después de la eliminación del mandril y el anillo de PTFE en la parte inferior de la tubería. Podríamos eliminar manga SA fácilmente poniendo el molde en un horno a 120 ° C durante 5 minutos, y luego las plantillas tubular de sal. (3) Se utilizó el método de fusión de sal. Es bien sabido que el método de la sal de fusión puede mejorar la interconectividad de los poros y las propiedades mecánicas, variando el tiempo de fusión 10. Por otra parte, ya que utilizamos PGS, macroporos fueron producidas por las partículas de sal durante el proceso de lixiviación, mientras que los microporos se han generado probablemente por vapor de glicerol formados durante PGS curado como hemos descrito previamente 11. Por lo tanto, este método tiene un gran potencial para la fabricación de andamios tubulares poroso con diferentes macro y micro-estructuras mediante la variación de las partículas de sal, así como PGS curar enfermedad. El acondicionamiento mecánico del biorreactor ha proporcionado la perfusión flujo pulsátil (media máxima del flujo = 14 ml / min, esfuerzo cortante máximo = 15,3 dinas / cm 2, la frecuencia = 0,5 a 1,7 Hz) y fisiológicamente relevantes de presión con el andamio PGS, lo que llevó a SMC crecimiento y la orientación (Fig. 4). Estos resultados son consistentes con estudios previos de información que se extienden cíclico en esta frecuencia y tensión de corte aumenta la proliferación de SMC 12, y la producción de proteínas ECM 13,14. Además del crecimiento de SMC y la orientación, la construcción de PGS apoyo a la producción de proteínas ECM, especialmente circunferencialmente organizado fibras elásticas (Fig. 5) dentro de la cultura de 3 semanas en el biorreactor. Algunos estudios con un elastómero andamio como una construcción de pequeño diámetro arterial han demostrado resistencia mecánica y la presión de rotura comparables a las arterias nativas 15, y una rápida integración de SMC en los andamios cumplen con spinner frasco de 16,17, mientras que las fibras elásticas no se encuentran en estas construcciones. Nuestros resultados sugieren que la distensión cíclica radial desde el biorreactor mejorar la transducción de señales mecánicas con mayor eficacia a las CML en PGS andamio, lo que probablemente contribuyó a la síntesis de elastina y de la organización. Desde las CML vasculares fueron las únicas células que producen proteínas ECM en nuestro enfoque, el endotelio quiescente y mejorar la resistencia mecánica es necesaria para lograr un éxito clínico de pequeño diámetro construye arterial. Nos han informado de que las células endoteliales co-cultivadas con SMC genera una monocapa y la expresión de proteínas fenotipo apoyado en nuestras condiciones de cultivo y el acondicionamiento mecánico 9. Por lo tanto, sobre la base de nuestro método aquí descrito, la modificación de las condiciones del experimento de co-cultivo sería un siguiente paso para mejorar las funciones de las construcciones resultantes y generar sólidas nonthrombogenic, y conforme arterial construcción similar a las arterias nativas.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> El ácido hialurónico sal de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7630 </td></tr><tr><td> Tetrahidrofurano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td></tr><tr><td> MCDB 131 </td><td> Mediatech </td><td> 15 a 100 CV </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Lonza </td><td> BW14-502F </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Mediatech </td><td> 25 a 005 CV </td></tr><tr><td> El ácido ascórbico </td><td> Fisher Scientific </td><td> A62-500 </td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico solución </td><td> Mediatech </td><td> 30 a 004-CI </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS) </td><td> Mediatech </td><td> 21 a 031 CV </td></tr><tr><td> Tissue-Tek compuesto óptima temperatura de corte, 4583 </td><td> Sakura Finetek </td><td> 25608-930 </td></tr></tbody></table>

elastomeric pgs scaffolds in arterial tissue engineering

La enfermedad cardiovascular es una de las principales causas de mortalidad en los EE.UU. y, sobre todo, la enfermedad coronaria aumenta con envejecimiento de la población y aumento de la obesidad 1. En la actualidad, la cirugía de bypass utilizando vasos autólogos, los aloinjertos, injertos sintéticos y que se conoce como un uso común de los sucedáneos de 2 arterial. Sin embargo, estos injertos tienen aplicaciones limitadas cuando un diámetro interior de las arterias es inferior a 6 mm, debido a la escasa disponibilidad, las complicaciones trombóticas, el desajuste de cumplimiento, y la hiperplasia de la íntima finales de 3,4. Para superar estas limitaciones, la ingeniería de tejidos ha sido aplicado con éxito como una alternativa prometedora para el desarrollo de pequeño diámetro que se construye arterial nonthrombogenic, robusto y compatible. Varios estudios previos han desarrollado estructuras de pequeño diámetro arterial con tri-laminar estructura, excelentes propiedades mecánicas y la presión de rotura comparables a las arterias nativas 5,6. Mientras que la fuerza de alta resistencia y presión de ruptura mediante el aumento de la producción de colágeno a partir de un material rígido o células hoja de andamio, estas construcciones aún tenía bajo la producción de elastina y el cumplimiento, que es un problema importante para causar el fracaso del injerto después de la implantación. Teniendo en cuenta estas cuestiones, la hipótesis de que un biomaterial elastoméricas combinadas con acondicionamiento mecánico que proporcionan elasticidad y llevar a cabo las señales mecánicas de manera más eficiente a las células vasculares, que aumentan la producción de matriz extracelular y apoyar la orientación celular. El objetivo de este informe es presentar una técnica de fabricación de andamios tubulares porosa y un condicionamiento mecánico dinámico para su aplicación a la ingeniería de tejido arterial. Se utilizó un elastómero biodegradables poli (sebacato de glicerol) (PGS) 7 para la fabricación de andamios tubulares porosa del método de fusión de sal. Células adultas de la primaria babuino del músculo liso (SMC) se sembraron en el lumen de los andamios, que se cultivan en nuestro biorreactor diseñado flujo pulsátil durante 3 semanas. Andamios PGS había espesor constante y una distribución aleatoria de macro y micro-poros. Acondicionamiento mecánico del bioreactor de flujo pulsátil SMC apoya la orientación y la mayor producción de MEC en los andamios. Estos resultados sugieren que los andamios de elastómero y el acondicionamiento mecánico de la cultura biorreactor puede ser un método prometedor para la ingeniería de tejidos arteriales.

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Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

PGS elastomérico andamios con células musculares lisas vasculares cultivadas en un biorreactor de flujo pulsátil puede llevar a prometedores de pequeño diámetro arterial construye con la producción de ECM nativa en un período de cultivo relativamente corto.

PGS elastomérico andamios en ingeniería de tejidos arteriales

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

elastomeric-pgs-scaffolds-in-arterial-tissue-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K vistas.  University of Pittsburgh. PGS elastomérico andamios con células musculares lisas vasculares cultivadas en un biorreactor de flujo pulsátil puede llevar a prometedores de pequeño diámetro arterial construye con la producción de ECM nativa en un período de cultivo relativamente corto.

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Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

Ingeniería de tejidos del intestino en un modelo murino

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Investigación

Bioingeniería

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Gradiente de densidad multicapa polimerización (DGMP): una técnica novedosa para la creación de multi-compartimiento, Andamios personalizables para Ingeniería de Tejidos

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Ingeniería de tejidos de un humano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Prueba de Tumores

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Electrospun fibroso Andamios de poli (glicerol-dodecanodioato) de Ingeniería Neural Los tejidos de las células madre embrionarias de ratón

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingeniería 3D Cellularized colágeno Geles para Vascular Regeneración Tisular

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microentornos-Sandwich como para aprovechar Celulares / Materiales Interacciones

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

La repoblación de las células epiteliales y Preparación de roedores matriz extracelular andamios para el Desarrollo del tejido renal

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingeniería de tejidos por intrínseca Vascularización en una<em&gt; En Vivo</em&gt; Cámara Ingeniería de Tejidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...