Este protocolo proporciona una estrategia sencilla para generar modelos de cultivo celular de adipocitos blancos y marrones que recapitulan fielmente in vitro, la fisiología del tejido adiposo que tenemos in vivo. Este protocolo permite el aislamiento simultáneo de preadipocitos blancos y marrones de ratones recién nacidos y las células que aislamos mediante este método evalúan la alta capacidad proliferativa y el potencial de diferenciación. Las células aisladas usando este acercamiento reflejan la complejidad del tejido adiposo mejor que otros modelos de la cultura.
Y se puede utilizar para estudiar con mayor precisión la función de los adipocitos en la obesidad y la diabetes. Nos centramos principalmente en la comprensión de la disfunción del tejido adiposo en la obesidad. Sin embargo, las células preparadas con este método también se pueden utilizar para estudiar preguntas básicas sobre la célula en la biología del desarrollo.
La clave para un experimento exitoso es determinar cómo identificar los depósitos adiposos blancos como estos depósitos, que son pequeños, pero muy ricos y proliferando preadipocitos puede ser difícil de distinguir en cachorros. La demostración visual ilustra lo simple que es este protocolo y permite la provisión de consejos para localizar y diseccionar los depósitos adiposos blancos y marrones. Ver el aislamiento del depósito es muy útil.
Para recolectar tejido adiposo blanco subcutáneo, corte la piel alrededor del abdomen de un cachorro recién nacido eutanásico y tire suavemente de la piel debajo de las piernas. Sin recoger ningún tejido de la piel, cosechar cuidadosamente el depósito de grasa, que aparecerá como un tejido alargado claro o blanco, delgado unido al interior de la piel o en la parte superior del cuádriceps. Enjuague el depósito cosechado en PBS y coloque el tejido adiposo en un tubo de 1,5 mililitros que contenga 250 microlitros de PBS y 200 microlitros de tampón de aislamiento 2X sobre hielo.
Para recolectar tejido adiposo marrón interescapular, tire de la piel de los omóplatos sobre la cabeza y levante el tejido adiposo marrón rojo profundo ubicado entre los omóplatos. Haga incisiones cuidadosamente alrededor del adiposo para separarlo del cuerpo y revise la consistencia y el color del tejido. Después del enjuague, coloque el tejido en un segundo tubo de 1,5 mililitros que contenga 250 microlitros de PBS y 200 microlitros de tampón de aislamiento 2X sobre hielo.
Cuando todos los depósitos hayan sido recolectados, use tijeras para picar suavemente cada depósito de cuatro a seis veces directamente dentro de los tubos y agregue 50 microlitros de colagenasa 10X en un tampón de aislamiento 2X a cada tubo. Luego invierta los tubos rápidamente para mezclar y colocar los tejidos en un mezclador de temperatura controlada durante 30 minutos a 37 grados Celsius y 1400 revoluciones por minuto. Al final de la digestión, coloque los tubos de nuevo en el hielo y filtrar los tejidos digestivos a través de coladores de células de 100 micras en nuevos tubos de 50 mililitros.
Para maximizar el rendimiento celular, enjuague cada tubo con un mililitro de medio de aislamiento y filtre este lavado a través del colador. Diluya las soluciones de tejido adiposo marrón y blanco a dos mililitros de suspensión de tejido por pozo por depósito en medio de aislamiento fresco. Luego platee dos mililitros de suspensión de tejido adiposo blanco a cada uno de cuatro a seis pozos y dos mililitros de suspensión de tejido adiposo marrón a cada uno de dos a tres pozos de una placa de seis pozos a través de un filtro de 100 micras por pozo.
Cuando todas las células hayan sido plateadas, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 60 a 90 minutos. Al final de la incubación, lave cada pozo con dos mililitros de medio sin suero y agite suavemente la placa para separar cualquier célula sanguínea del fondo de los pozos. Después de tres lavados, agregue dos mililitros de medio de aislamiento fresco a los pozos y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular.
Cuando las células alcancen de 80 a 90% de confluencia, recubre las nuevas placas de destino con gelatina estéril al 0,1% en agua destilada a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Mientras las placas están incubando, lave las células con PBS antes de tratar con tripsina durante tres minutos en la incubadora de cultivo celular. Cuando las células se han desprendido, pipetee la suspensión de la célula varias veces para maximizar la recuperación de la célula y transferir las células a un nuevo tubo.
Cuando se hayan recogido todas las células, lave cada pozo con un mililitro de medio de aislamiento y tire de los lavados con la suspensión celular. Recoger las células por centrifugación y resuspend el pellet en tres a cinco mililitros de medio de aislamiento para el recuento. Diluya las células a la concentración adecuada para el revestimiento en medio de aislamiento fresco y lave las placas recubiertas de gelatina con PBS para eliminar cualquier exceso de gelatina.
Luego sembra las células en las placas recubiertas de gelatina y devuelve las células a la incubadora de cultivo celular. Cuando las células alcancen la confluencia, substituya el medio de aislamiento por un medio de diferenciación. Si diferencia los preadipocitos de tejido adiposo marrón, agregue también una triyodotironina nanomolar.
Después de 48 horas, actualice el medio con el volumen adecuado de medio de mantenimiento por cultivo. En este momento, la acumulación de pequeñas gotas de líquido dentro de las células debe hacerse visible bajo microscopía de campo brillante. Incluso después del filtrado, algunos desechos celulares y células sanguíneas permanecen dentro de la suspensión celular.
Los lavados suaves una hora después del revestimiento eliminarán las células no relevantes, ya que los preadipocitos se unen rápidamente al fondo del pozo. Aunque los preadipocitos blancos y marrones aislados de crías recién nacidas tienen una alta capacidad proliferativa, el rendimiento de los preadipocitos blancos es generalmente el doble que el de los preadipocitos marrones por depósito. Por lo tanto, si se desean culturas sincronizadas, esta densidad inicial de los preadipocytes blancos se debe calcular por consiguiente.
Al final de la diferenciación, las células aparecerán estar cargadas con gotitas de lípidos y expresarán marcadores clásicos de adipocitos blancos y marrones, respectivamente. En este análisis comparativo del consumo de oxígeno en una prueba de esfuerzo mitocondrial de adipocitos primarios blancos y marrones en condiciones basales, así como en respuesta a estimuladores conocidos de la función mitocondrial, se puede observar esta capacidad bioenergética específica de cada tipo celular. Recuerda que estamos aislando células vivas y que queremos cultivarlas durante varios días.
Así que asegúrese de mantener condiciones estériles durante el aislamiento para evitar la contaminación, que puede comprometer el cultivo posterior. Este método genera adipocitos completamente maduros que se pueden utilizar para diferentes aplicaciones, incluyendo ensayos funcionales, pantallas genéticas o químicas, o perfiles ómicos para estudiar los mecanismos autónomos de las células que afectan la función de los adipocitos.
