La resistencia a la insulina se puede evaluar en adipocitos primarios, lo que permite el estudio de donantes en diferentes contextos fisiopatológicos, como magros versus obesos, o células de diferentes depósitos de grasa. Los adipocitos primarios conservan muchas de sus propiedades intrínsecas y pueden cultivarse en condiciones definidas durante un largo período de tiempo, con un estricto control de los factores ambientales celulares. Para iniciar el proceso de diferenciación, las células deben estar al 80% de confluencia.
Si la diferenciación comienza en una confluencia menor o mayor, las células se diferenciarán menos o perderán su capacidad de diferenciación. Después de sacrificar al animal, desinfecte a los ratones frotando con etanol al 70%. Diseccionar el tejido adiposo subcutáneo inguinal de cada ratón y recogerlo en un tubo cónico de 15 mililitros, que contiene 15 mililitros de solución de colagenasa tipo uno en hielo.
Cortar el tejido adiposo en trozos pequeños con tijeras quirúrgicas estériles y digerir las muestras por incubación con solución de colagenasa tipo uno a 37 grados centígrados en un agitador orbital a 150 RPM durante 30 minutos. Revise la digestión cada 10 minutos para asegurarse de que funciona y para evitar la digestión excesiva. Filtre con una jeringa de malla de 200 micrómetros para eliminar el tejido no digerido con colagenasa y pase el filtro sobre el borde del tubo para drenar tantas células como sea posible en la solución.
Agregue 15 mililitros de DMEM frío 1% BSA para detener la digestión y centrifugar a 400 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar la capa superior que contiene adipocitos maduros y la mayor parte de la capa líquida. Agregue 20 mililitros de PBS 2% FBS frío y vuelva a suspender el pellet.
Después de centrifugar nuevamente durante cinco minutos, retire el sobrenadante aspirando la capa superior para eliminar los adipocitos y la grasa restantes. Resuspender el pellet en un mililitro de tampón de lisado ACK. Incubar en hielo durante cinco minutos.
Agregue 10 mililitros de PBS 2%FBS y mezcle. Después de centrifugar durante cinco minutos y aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de solución anti-FC. Incubar en hielo durante cinco minutos y transferir la suspensión celular a un tubo de cinco mililitros que encaja en los bastidores preenfriados de un separador de celdas magnéticas.
Después de centrifugar durante cinco minutos y eliminar el sobrenadante, agregue 200 microlitros de la mezcla de biotina de anticuerpos monoclonales CD 31 y biotina de anticuerpos monoclonales CD 45. Mezclar bien e incubar en hielo durante 15 minutos. Luego agregue 400 microlitros de PBS 2% FBS y centrifugar nuevamente a 400 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Aspirar el sobrenadante e incubarlo en 100 microlitros de microperlas antibiotina durante 15 minutos en hielo. Agregue 400 microlitros de PBS 2% FBS y centrifugar nuevamente a 400 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, como se mostró anteriormente. Después de desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 350 microlitros de PBS 2% FBS.
Para eliminar los agregados celulares, o partículas grandes, de las suspensiones de células individuales con un filtro de preseparación de 70 micrómetros, active el filtro con 100 microlitros de PBS 2% FBS. Pase la suspensión celular a través del filtro y recójala en un tubo limpio. Luego lave el filtro con 100 microlitros de PBS 2% FBS.
Para realizar la separación magnética de las células utilizando la estrategia de separación negativa, coloque la muestra en la posición A de la rejilla refrigerada y dos tubos vacíos en las posiciones B y C para recuperar las células no marcadas y etiquetadas. Luego cargue el tampón de lavado y el tampón de ejecución en las botellas correspondientes. En la sección de separación, seleccione el número de muestras que desea separar y seleccione el protocolo de agotamiento.
Presione ejecutar e inicie la separación. Al final del programa, recupere las celdas no etiquetadas. A continuación, cubra una placa de 12 pocillos con una matriz de membrana basal agregando 400 microlitros de matriz de membrana basal al 2,5% para cubrir toda la superficie de cada pozo.
Retire el exceso de solución y deje que la placa se seque dentro de la campana de flujo laminar durante al menos una hora. Después de centrifugar durante cinco minutos y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de medio de crecimiento. Sembrar las células precursoras de adipocitos, o APC, en un pocillo de la placa de 12 pocillos previamente recubierta con una matriz de membrana basal al 2,5%.
Incubar a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%, y cambiar el medio cada 48 horas hasta que las células alcancen el 80% de confluencia. Después de eliminar el medio por completo, lave las células con 350 microlitros de PBS 2% FBS. Cosechar las células con 350 microlitros de 0,05% tripen EDTA durante dos minutos a 37 grados centígrados, y añadir dos mililitros de medio de crecimiento.
Recoja las células en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y centrifugar a 400 G durante cinco minutos. Pasar los APC a placas de 12 pocillos, previamente recubiertas con una matriz de membrana basal al 2,5%, e incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Cambiar el medio cada 48 horas hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.
Al 80% de confluencia, aspirar cualquier medio de crecimiento y reemplazarlo con 500 microlitros de medio de diferenciación, que contiene 3,3 nanomolares de proteína morfogenética ósea en cada pocillo. Después de 48 horas, reemplace el medio con 500 microlitros por medio de diferenciación de pozo, y el cóctel de diferenciación. Retirar el medio 72 horas después y añadir 100 nanomolares de insulina en 500 microlitros de medio de diferenciación fresco.
48 horas después, inducir resistencia a la insulina con cuatro nanogramos por mililitro de factor de necrosis tumoral alfa, o TNF alfa. Aspirar cualquier medio de diferenciación y sustituirlo por 500 microlitros de medio simple 2% FBS con TNF alfa. Después de incubar durante 24 horas, agregue cuatro nanogramos por mililitro de TNF alfa en un medio simple 0% FBS.
Active la vía de señalización de la insulina 24 horas después agregando 100 nanomolares de insulina e incube durante 15 minutos a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%, como se mostró anteriormente. Después de la incubación, retire el medio y lave con 500 microlitros de PBS, incluya un pozo de control sin el tratamiento con insulina. Extraer proteínas y medir la fosforilación de marcadores de señalización de insulina mediante Western blot.
En esta figura se muestran células precursoras de adipocitos subcutáneos al 80% de confluencia antes de inducir la diferenciación en las placas de cultivo de 12 pocillos, y adipocitos primarios después de siete días de diferenciación inductora. La resistencia a la insulina inducida por TNF alfa en adipocitos primarios subcutáneos se demostró por la disminución de la fosforilación inducida por insulina del receptor de insulina, el sustrato del receptor de insulina uno y la proteína quinasa B o AKT. La membrana se probó con receptor de insulina antifosforilada, sustrato de receptor de insulina antifosforilada uno, AKT antifosforilada y se utilizó tubulina antibeta como control de carga.
La señal se visualizó con detección de quimioluminiscencia. Aquí se muestran las manchas representativas y la cuantificación de tres experimentos independientes. Al intentar este procedimiento, una cosa que debe tenerse en cuenta es que la inducción de resistencia a la insulina con TNF alfa es con 2% FBS durante 24 horas y con 0% FBS durante las últimas 24 horas.
