Para investigar los aspectos biológicos del tejido adiposo marrón, es esencial eliminar el tamaño adiposo marrón purificado. Actualmente no viene en purificación de tamaño adiposo marrón y las masas están disponibles. En este estudio, desarrollamos un protocolo sencillo para abordar este problema.
Ahora, se requieren habilidades para este protocolo. Necesita muchos menos materiales de estudio que otros métodos y el tamaño adiposo marrón purificado se puede utilizar directamente para el análisis de expresión génica y proteica. Este protocolo proporciona un nuevo método para estudiar la biología del tamaño adiposo marrón clásico.
También se puede aplicar para estudiar el proceso de pardeamiento de los adipocitos blancos. Demostrando el procedimiento estará Amanda, una asistente de investigación de mi laboratorio. Comience colocando el matraz con MTD y solución digestiva en un agitador magnético a 60 rotaciones por minuto en una incubadora de 35 grados centígrados durante 30 minutos.
Use una pipeta de un mililitro para interrumpir los grupos de tejido agregados de las rodajas BAT alrededor de la barra de agitación. Después de la digestión, coloque un filtro de filtro de 70 micrómetros sobre un tubo de centrífuga limpio de 50 mililitros y pipete alrededor de cuatro mililitros de suspensión celular a través del filtro. Luego lávelo con cuatro mililitros de solución de iodixanol al 12%.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar las células con solución de iodixanol y luego transferir la mezcla celular a dos tubos de ensayo de poliestireno transparente de cinco mililitros. Coloque los tubos de poliestireno que contienen la mezcla celular en hielo durante una hora, haciendo que los BA formen una capa en la parte superior. Saque 20 microlitros de los BA aislados para examinarlos con microscopio.
Para el aislamiento de ARN y proteínas, pipetear la capa de BA en dos tubos de microcentfuga de 1,7 mililitros. Luego retire con cuidado la solución yodixonal excesiva sin interrumpir la capa de BA. Luego agregue un mililitro de TRIzol en la solución celular para aislar simultáneamente el ARN, el ADN y la proteína y mezclar lo suficiente como para afectar a las células.
Para separar las fases, agregue 200 microlitros de cloroformo y centrifugar al tubo a 9, 981 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, use la fase acuosa para el aislamiento de ARN. Transfiera 300 microlitros de la fase orgánica a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros y agregue 750 microlitros de etanol al 100%.
Después de vortexing durante 10 segundos, agregue 200 microlitros de 1-Bromo-3-cloropropano y vortex nuevamente durante 10 segundos. Agregue 600 microlitros de agua destilada doble antes de vortex durante 10 segundos. Deje reposar la solución mezclada durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Después de la centrifugación, agregue 9, 981 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Las fases se separarán con la fase proteica localizada en la capa media. Retire la solución acuosa superior y agregue un mililitro de etanol al 100% en la solución restante.
Después de la centrifugación a 9, 981 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, deseche el sobrenadante y lave el pellet con un mililitro de etanol al 100%. Centrifugar a 9, 981 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de retirar el sobrenadante, seque al aire el pellet durante 10 minutos a temperatura ambiente y mida el peso del pellet húmedo.
Agregue una solución de SDS al 1% en una proporción de 20 microlitros por miligramo de pellet. Disuelva el pellet completamente colocando el tubo en una coctelera caliente a 55 grados centígrados y 11 g durante cinco a 10 minutos. En el protocolo, PBS que contenía 3% BSA se utilizó para separar los BA de BAT.
Las células aisladas tenían forma de frambuesa con gotitas de lípidos multiloculares en el interior y eran tdTom positivo, lo que confirma que eran BA. La proteína se aisló de los BA con un protocolo GTPC mejorado y luego se examinó con un gel SDS-PAGE. Se observó una banda dominante asociada con BSA en la muestra de BA, lo que sugiere su interferencia en la extracción de proteínas.
Para evitar la interferencia de BSA, se utilizó una solución de yododinonal al 6% para el aislamiento de BA, que tenía una forma típica de frambuesa y contenía gotas de lípidos multiloculares. Las proteínas extraídas de estos BA se separaron bien en el gel SDS-PAGE. Se encontró que estas células eran tdTomato positivas, mientras que las células recuperadas del pellet eran tdTomato negativas sin gotas de lípidos obvias, lo que sugiere una separación eficiente de las BA de las células no grasas.
En el análisis de expresión génica, los niveles de ARNm de UCP1 y PDGFA fueron significativamente más altos en los BA aislados. Pero el ARNm de PDGFRA solo se detectó en BAT. Se encontró proteína UCP1 enriquecida en BA aisladas.
Se detectó EDGFR alfa en las MTD, pero no en las BA aisladas. Estos resultados confirman la eficacia del método para aislar BA y demuestran que los BA aislados son adecuados para estudios de expresión génica y proteica. Al intentar este protocolo, use tampón de digestión fresco para disociar el tejido adiposo marrón y evitar la formación de grumos de tejido durante el período de digestión.
Este nuevo método facilita la investigación de la biología del tejido adiposo marrón en un solo nivel de toma celular. Al aplicar este método, se pueden realizar estudios de GN y expresión de proteínas con adipocitos marrones puros que diseccionan con precisión el programa de expresión génica de los adipocitos marrones, sin preocuparse por la contaminación original de las células no grasas.
