Nuestro protocolo permite una identificación eficiente de genes o combinaciones de genes que bloquean la invasión del cáncer en el espectador. el sobreculto no requiere instalaciones avanzadas para el mantenimiento de los animales. En su conjunto, como un genérico o general, las bibliotecas especiales se pueden proyectar en cuestión de varias semanas en el visor.
Este sistema de detección ayudará a los investigadores a descubrir nuevos objetivos genéticos terapéuticos o combinaciones de objetivos genéticos que se pueden usar para bloquear la metástasis del cáncer. Para la inyección intravenosa, concentre las células a 0.5 a 1 millón de células por mililitro, usando 1X PBS helado para diluir o volver a suspender las células. Espere que se necesite aproximadamente un mililitro de suspensión celular por cada 10 embriones.
Para montar el aparato de inyección, monte una aguja en la jeringa y luego extienda la aguja de la jeringa con un tubo de tres a cinco centímetros de largo. Rompa la punta de la aguja de borosilicato con forrceps finos. Cargue la jeringa con 50 a 200 microlitros de la suspensión de células cancerosas.
E inserte la aguja de borosilicato en el tubo. Inspeccione la aguja en busca de obstrucciones celulares y burbujas de aire. Si se observa obstrucción celular dentro del capilar, retire el capilar, vuelva a suspender las células y reemplácelo con un nuevo capilar.
Use el émbolo para expulsar cualquier burbuja. Retire la tapa de la cubierta y transfiera el embrión debajo del estereoscopio. Identifique la vena apropiada que se inyectará en la superficie de CAM; que normalmente es solo un poco más ancha que el diámetro de la punta de la aguja de borosilicato y se encuentra a medio camino entre el embrión y la pared del plato de pesaje.
En general, es más fácil de inyectar en el punto inmediatamente adyacente a la bifurcación de la vena. Presione la punta de la aguja contra la pared de los vasos sanguíneos y aplique una presión suave en la misma dirección que el flujo sanguíneo. Si es necesario, use un hisopo de algodón para ayudar a anclar o estabilizar el recipiente que se está inyectando.
Presione suavemente el émbolo de la jeringa durante 2 a 10 segundos hasta que se inyecte el volumen deseado. Deseche el embrión si aparece sangrado excesivo o acumulación de líquido claro en el lugar de la inyección. Retire la aguja de la CAM y aplique suavemente el sitio de inyección con un hisopo de algodón para eliminar la sangre o el exceso de células cancerosas.
Cubra el embrión inyectado en el plato de pesaje con la tapa y devuélvalo a la incubadora. Repita el procedimiento hasta que se inyecten todos los embriones. Inspeccione visualmente los embriones en busca de bacterias o moho contaminación o muerte.
Y desechar los embriones contaminados de acuerdo con los procedimientos de eliminación de laboratorio. Asegúrese de que las colonias metastásicas parezcan de forma uniforme durante los primeros uno a tres días después de la inyección. E identificar colonias metastásicas invasivas o no invasivas en los días cuatro a cinco después de la inyección.
En el quinto día después de la inyección, retire los embriones de la incubadora e inspeccione y localice las CAL embrionarias para la distribución de colonias metastásicas. Bajo el microscopio de disección, tire suavemente del tejido CAM que contiene la colonia metastásica de interés hacia arriba con forrceps finos y córtelo con tijeras quirúrgicas. Transfiera el tejido CAM a un tubo vacío y estéril de 1,5 mililitros y cierre la tapa del tubo.
Repita el procedimiento de escisión hasta que todas las colonias de interés se recojan en tubos separados. Picar suavemente el tejido CAM en un tubo de micro centrífuga, utilizando una aguja estéril separada de calibre 18 para cada colonia. Agregue 100 microlitros de solución de colágeno-A 1X e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
Gire hacia abajo las células y el tejido CAM a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspirar la solución de colágeno-A y volver a suspender los medios incompletos de las células para la línea celular de interés. Luego vuelva a girar las células y el tejido.
Vuelva a suspender células y piezas de tejido en un mililitro de medios completos y factor de selección, si corresponde. Luego transfiera a un solo plato de cultivo de tejidos de 12 pozos bien. Durante las próximas una a tres semanas, controle las células cancerosas diariamente para ver si hay crecimiento y contaminación.
Cuando las células alcanzan el 70 al 80% de la confluencia, transfiéralas a un plato de cultivo de mayor volumen. Proceda a la secuenciación o a la siguiente ronda de selección, tan pronto como se alcance el número adecuado de células cancerosas. Los embriones que muestran una acumulación de células cancerosas debido a una inyección fallida, se pueden ver en la mayoría de los capilares.
Cuando se alcanza la concentración celular óptima y la duración de la inyección, el quinto día las células transducidas después de la inyección deben producir una amplia variedad de fenotipos de colonias, con la mayoría de las colonias invasivas según lo determinado por las células cancerosas que aparecen dispersas en el tejido CAM. Se debe prestar atención a las colonias metastásicas que parecen compactas y están ubicadas lo suficientemente lejos de las colonias vecinas como para que puedan extirparse con pórceps y tijeras y una pieza de tejido CAM. Un golpe de pantalla positivo aislado debe mostrar el fenotipo de colonia compacta al volver a inyección.
Para la medición de los contactos de los vasos sanguíneos de las células cancerosas, se debe prestar atención al brillo de la mancha de la pared vascular y se debe inyectar la cantidad adecuada de lectinas para la señal de la pared vascular. Al intentar este protocolo, evite la inyección inferior o excesiva y elimine el sangrado excesivo o la acumulación de líquido. Varios genes nuevos que están impulsando la invasión de células cancerosas en el espectador se han identificado utilizando esta técnica.
