Queremos reconocer a Tyson Foods Inc. para ofrecer generosamente los huevos fertilizados. Shanna Arnold jugó un papel decisivo durante el rodaje de este protocolo. Trenis Palmer fue apoyada por los Institutos Nacionales de la Salud bajo el Premio Ruth L. Kirschstein Servicio Nacional de Investigación (F31 Instituto Nacional del Cáncer). Este trabajo fue parcialmente financiado por una beca # 700537 CCSRI a JDL y los NIH / NCI subvención # CA120711-01A1-01A1 y CA120711 a AZ.

1. La preparación de los huevos de xenoinjerto (metástasis espontánea) <ol><li> Recién puestos los huevos fertilizados de pollo se incuban en una incubadora de rotación de 10 días a 100 ° F y 60% de humedad. Los huevos se giran cuatro veces cada hora. </li><li> El día 10 en el desarrollo de los huevos se colocan a su lado en un bastidor de huevo. Una fuente de la lámpara cuello de ganso o de otro tipo de luz adecuada se utiliza para las velas de los huevos por el resplandor de la luz en la cáscara del huevo en el extremo romo del huevo donde se encuentra la sacos aéreos. </li><li> La vena corioalantoidea es ubicar y marcar. Esta vena se localiza en la parte superior de la cáscara del huevo donde se encuentra el cruce de varios grandes vasos sanguíneos. En este punto de ramificación de los vasos sanguíneos se despliega, lejos de la CAM y se une al embrión. Una caja cuadrada de 1 cm se dibuja con un lápiz en la cáscara del huevo de aproximadamente 1 cm de distancia desde el punto de ramificación de la vena. La zona, incluyendo alrededor de la plaza y se limpia con un algodón empapado en yodo. </li><li> Usando una herramienta de corte rotativo (Dremel) equipado con una piedra de carburo de silicio de molienda (parte Dremel # 84922) se perfora un agujero a través del extremo romo del huevo en la cámara de aire. El uso de este mismo instrumento se taladra un agujero en la plaza previamente dibujado en la parte superior del huevo, sin llegar a la membrana de la cáscara del huevo. Una aguja de la jeringa de calibre 25 con una fresa fina en la punta se utiliza para hacer un pequeño agujero en la membrana de la cáscara de huevo con cuidado de no romper el subyacente CAM. La CAM es posteriormente separado de la membrana de la cáscara del huevo en el área de la plaza con una suave succión creada con una pipeta automática de la ayuda provista de una pieza de ¼ &quot;tubo Tygon colocado junto al agujero en la sacos aéreos. Al aplicar succión, una bolsa de aire debe debajo del agujero en la plaza que significa que la CAM se ha logrado caer fuera de la cáscara del huevo. Después de la CAM se ha caído, el agujero en el saco de aire y el agujero situado en la plaza cerca de la vena corioalantoidea se sella con un pedazo de cinta de la cinta de laboratorio. Los huevos se comercialicen posteriormente en una incubadora fija a 100 ° F y 60% de humedad en previsión de injerto de las células tumorales. Véase la figura 1 para una descripción secuencial. </li></ol> 2. La preparación de los huevos para la inyección intravenosa (metástasis experimental) <ol><li> Recién puestos los huevos fertilizados de pollo se incuban en una incubadora de rotación de 12 días a 100 ° F y 60% de humedad. Los huevos se giran cuatro veces cada hora. </li><li> El día 12 en el desarrollo de los huevos se colocan a su lado en un bastidor de huevo. Una fuente de la lámpara cuello de ganso o de otro tipo de luz adecuada se utiliza para las velas de los huevos por el resplandor de la luz en la cáscara del huevo en el extremo romo del huevo donde se encuentra la sacos aéreos. </li><li> La vena corioalantoidea es ubicar y marcar. Un rectángulo de 1 cm por 0,5 cm se dibuja con un lápiz en la cáscara de los huevos directamente sobre la vena. La zona, incluyendo alrededor de la plaza y se limpia con un algodón empapado en yodo. </li><li> Una pequeña ventana se crea en la cáscara del huevo en el lugar se dibuja con la broca Dremmel (# 118). La ventana se quita para exponer la membrana de la cáscara del huevo subyacente, que posteriormente se hizo transparente con una gota de aceite mineral. Vea la figura 5A para una representación gráfica. </li><li> En este punto, el agujero en el saco de aire y el agujero situado en la plaza cerca de la vena corioalantoidea se sella con un pedazo de cinta de la cinta de laboratorio. Los huevos se comercialicen posteriormente en una incubadora fija a 100 ° F y 60% de humedad a la espera de la inyección de las células tumorales. </li></ol> 3. Preparación de las células tumorales para el injerto o inyección. <ol><li> De xenoinjerto, las células tumorales se desprenden de los platos de su cultura a través de tripsina / EDTA y se lava con 10 volúmenes de tampón fosfato salino (PBS) para eliminar cualquier residuo de medios, la tripsina, o EDTA. </li><li> Para la inyección IV, las células cultivadas son separadas utilizando la disociación enzimática celular solución, y se lavaron con DMEM libre de suero. y) </li><li> Las células se contó con un hemocitómetro y se resuspendieron en PBS a 10-40 million células / ml para el injerto, o, alternativamente, se resuspendieron en DMEM libre de suero en 1 millón de células / ml para inyección IV. </li></ol> 4. Injerto de las células tumorales a la recién expuesta CAM (metástasis espontánea) <ol><li> Los huevos son retirados de la incubadora y una pequeña ventana se reduce a la ubicación de la plaza previamente dibujadas en la bolsa de aire nuevo se ha formado. Esto se hace más fácilmente con una herramienta rotativa equipada con un disco de corte (herramienta Dremel con el # 409 de la rueda de corte circular). Un par de pinzas de punta de aguja se utiliza para eliminar la pequeña sección de la cáscara del huevo y exponer la CAM subyacente. </li><li> El uso de un aplicador de algodón (marca Fisher # 23-400-001) de la CAM es erosionada 5 veces. Un poco de sangre debe ser evidente en el algodón. Inmediatamente después de dañar la CAM, 25μl de la suspensión celular se coloca en la zona dañada. El número óptimo de las células es determinada empirically pero puede variar de 0.5x10 5 a 6 1X10. La ventana en el huevo es sellado herméticamente con cinta adhesiva y los pollos se deja reposar durante 10-15 minutos con el fin de permitir que las células se asienten. Después de 15 minutos los huevos se devuelven a la incubadora estacionaria. </li><li> Los tumores pueden crecer durante 5-8 días, dependiendo de la aplicación específica y la naturaleza de la línea de células tumorales utilizan. Véase la figura 1 para una descripción secuencial. </li></ol> 5. La inyección intravenosa de las células tumorales (metástasis experimental) <ol><li> El uso de un calibre 30 100μl jeringa de insulina de la suspensión celular se inyecta en la vena alantoideo de cada embrión, los huevos fueron devueltos a una incubadora inmóvil y permaneció allí por un período adicional de 1-7 días. </li><li> En momentos distintos, el pulmón o el menor CAM se recogen de cada embrión y tratados para la detección de células tumorales, como se describe a continuación. </li></ol> 6. Tumores de la cosecha y los tejidos de pollo <ol><li> Un área de disección se prepara. El ensayo detecta las células metastásicas mediante la cuantificación de ADN humano con un enfoque de PCR de alta sensibilidad. Por tanto, es muy importante para evitar la contaminación con ADN exógeno. Disecciones se realizan en un área específica y en las disecciones de las herramientas se limpian entre cada animal. Con el fin de evitar la contaminación cruzada de las muestras en todo el proceso de disección tres series distintas de herramientas se utilizan: uno para cortar los huevos, uno para la extracción del tumor primario y otro para la eliminación de los órganos internos. Además, cuatro contenedores de lavado se utilizan para la secuencia de enjuague de las herramientas entre cada animal. En la secuencia, estas soluciones son: 1) el agua doblemente destilada, 2) agua doblemente destilada, 3) de cloro, y 4) El 70% de etanol. </li><li> Los óvulos son retirados de la incubadora estacionaria y se coloca en hielo durante 15 minutos para anestesiar y practicar la eutanasia a los animales. Las ventanas se abren de tal manera que los tumores se hacen visibles. Abrir las ventanas más grandes mediante la eliminación de algunas de la cáscara del huevo puede ser necesario. Los tumores primarios se resecan de la CAM, se pesaron y se procesaron para histología. </li><li> La chica se retira de la cáscara de huevo mediante la reducción de la capa radialmente en dos mitades iguales. El embrión se decanta de la concha cortada y se transfiere a un lado del pecho limpio pesar bote. El animal se diseca con el uso de un conjunto fresco y limpio de herramientas. El animal se abre cortando a través del esternón. Una vez que el embrión está abierto, un trozo del hígado, ya sea en el lóbulo izquierdo o derecho se recoge. Los órganos internos son posteriormente eliminados por tirando suavemente del esófago adjunta a la molleja y el corte de la visera que se conectan los órganos. Con el fin de recoger los pulmones corte de la caja torácica se abre la placa de pecho se separa y se extrae el corazón. En este punto, es posible cortar alrededor de los cuatro lados de los pulmones (la parte superior más cercano a la cabeza del lado izquierdo a lo largo de la caja torácica, la parte inferior cerca del diafragma y la parte derecha a lo largo de la tráquea). En aras de la coherencia, el mismo pulmón se recoge en cada animal. Cosecha muestras de tejido se almacenan a -20 ° C para su uso posterior o pueden ser procesados ​​de inmediato para el aislamiento de ADN. </li></ol> 7. Aislamiento de ADN genómico y análisis de PCR cuantitativa <ol><li> ADN genómico se extrae de los tejidos utilizando el SYBR Green Extract-N-Amp PCR tejido Kit (Sigma-Aldrich Catálogo # XNATRG). El ADN extraído se pueden transferir a un tubo eppendorf limpio y se almacenan a -20 ° C o utilizarse de inmediato. Es importante para diluir el ADN 1:50 en agua libre de nucleasa antes de utilizarla en la posterior reacción de PCR. Por otra parte, el ADN puede ser extraído por medio de cualquier número de protocolos estándar de extracción de ADN (Zijlstra et al., 2002). </li><li> El ADN humano se detecta en los tejidos de pollo con PCR cuantitativa específica para el consumo humano secuencias Alu. PCR cuantitativa utilizando Alu primers específicos se realiza mediante la amplificación verde SYBR del kit Exract-N-Amp. El kit de PCR viene con una mezcla de reacción que contiene 2x SYBR verde, buffer, dNTPs sales, Taq polimerasa y el anticuerpo Jumpstart Taq. La mezcla de reacción se compone en un volumen final de 15μl, con 0.4μM de cada cebador. Para la mayoría de los casos utilizando el ADN extraído diluido 1:50 proporcionará datos cuantitativos, sin embargo, la cantidad óptima de ADN puede ser necesario optimizar empíricamente. Pollo primers GAPDH se utilizó como control interno de la PCR se ejecuta bajo las siguientes condiciones para las secuencias Alu: activación de la polimerasa a 95 º C durante 2 min seguido por 30 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 63 ° C durante 30 s. , 72 ° C durante 30 s. Las condiciones de reacción para el pollo GAPDH son idénticos a los descritos para Alu sin embargo, puede ser necesario ampliar la PCR a 40 ciclos. </li><li> El análisis cuantitativo de las metástasis se realiza utilizando el método ΔΔCt comparar los grupos experimentales con un grupo control (Schmittgen y Livak, 2008;. Zijlstra et al 2,002). Por otra parte una curva estándar se pueden generar mediante una serie de dilución de las células tumorales humanas extraídas con el kit de Extract-N-Amp (Zijlstra et al., 2002). La significación estadística se evaluó mediante prueba t de Student o el análisis de varianza de los grupos control y experimental. </li></ol> 8. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. El modelo de embrión de pollo metástasis. A) Un diagrama que ilustra el panel de cuatro aparición de la modelo en la sección transversal en los pasos clave: 1. Después de 10 días de incubación. La CAM ha alcanzado casi el tamaño máximo. Las arterias y las venas son claramente visibles con la vena alantoideo posicionado en contra de la parte superior del huevo. 2. El huevo inmediatamente después de perforar dos agujeros en la cáscara del huevo: una en el lado de sacos aéreos y el punto de unión de la vena alantoideo uno. 3. La aparición después de un leve vacío se ha utilizado para evacuar a los sacos aéreos y soltar la CAM. Las células tumorales (azul) se aplican a la CAM caído. 4. Después de permitir que el injerto de las células tumorales a crecer, el tumor, junto con los tejidos del embrión de pollo se cosechan para el análisis B) Una representación de serie del modelo. 1. La incubación de los huevos., 2. Marcar la ubicación de la vena alantoideo., 3. Taladrar agujeros en la cáscara del huevo., 4. Una caída del CAM., 5. Cortar una abertura para el injerto de las células tumorales., 6. La aplicación de las células tumorales., 7. De enfriamiento de los huevos en hielo antes de la recogida de tejidos., 8. La cosecha del tumor después de 7 días de crecimiento. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Histología de los tumores de la CAM. Tejidos tomados de la membrana corioalantoidea teniendo tumor se fijó en formalina, se cortaron y se procesaron con un tricrómico. A) HEp3 tumor después de siete días de crecimiento en la CAM. B y C muestran las regiones de una magnifica muestra tanto del tumor y el estroma. D) normales CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. El análisis cuantitativo longitudinal de la metástasis. Variantes de la cabeza y el cuello con carcinoma HEp3 la capacidad metastásica de alta o baja (HEp3 M (Alta) y HEp3 M (bajo), respectivamente) fueron analizados por su capacidad para difundir el uso Alu PCR. Diez animales fueron analizados en cada momento durante la duración de 7 días. Estas muestras se cuantificó con una curva estándar y expresó posteriormente como # cells/50mg tejido. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. La inhibición de las células de metástasis espontánea en animales tratados con el anticuerpo 1A5 inhibir la metástasis. Los tumores se forman con 5x10 5 células HEp3 aplicada a la medicina complementaria y alternativa del día 10 embriones. Tres días después de la aplicación de las células tumorales la mitad de los animales fueron tratados con el anticuerpo anti-CD151 1A5. Los pulmones de los animales portadores de tumores se cosecharon dos días más tarde y se somete a la PCR cuantitativa en tiempo real de aluminio. Por el contrario cuantitativas PCR en tiempo real de chGAPDH se utilizó para confirmar la presencia de cantidades equivalentes de ADN genómico de acogida (El método ΔΔCt se utilizó para comparar los dos grupos cuantitativamente (B). <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Evaluación de la detención, el crecimiento y intravasation en la cascada metastásica. Fundamentalmente, la metástasis de un órgano secundario se define por las contribuciones de los tres aspectos: paro, tasa de crecimiento, y la tasa de intravasation. Estos pueden ser cuantificados usando una combinación de metástasis experimental (A) y la metástasis espontánea (B). Usando la metástasis experimental (A) la detención se define como el número de celular detecta después de la inyección 2h. Supervivencia y el crecimiento de células detenidas se determina como el cambio en la inyección de células de puesto: 24 horas. El crecimiento se define como la tasa de proliferación durante los días 3-7. Intravasation se determina mediante la metástasis espontánea (B), donde las células del número intravasated se define como la carga de presentar metástasis en el día 7 que supera el valor predicho por el crecimiento de la carga metastásica presente en el día 6. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Visualizar la expansión de la metástasis en el CAM. HEp3 células que expresan GFP se inyecta por vía intravenosa en 12 días de desarrollo. El día 1, 3 y 5 un huevo fue sacrificado y una sección de la CAM fue fotografiada con un microscopio estereoscópico fluorescente. El fondo de color verde oscuro se crea por la cáscara del huevo, los vasos se puede ver como las líneas de negro, y las células tumorales se ven como brillantes manchas verdes.

<ol>
	<li>Ghiso, A. g. u. i. r. r. e., Kovalski, J. A., K, ., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling.">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li><li>Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+system+for+studying+metastasis+using+the+embryonic+chick.">A model system for studying metastasis using the embryonic chick.</a> Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).</li><li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse,+rat,+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos.">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li><li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination.">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).</li><li>Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proMMP-9+by+a+plasmin/MMP-3+cascade+in+a+tumor+cell+model.+Regulation+by+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases.">Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases.</a> Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).</li><li>Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay.">Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li><li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles.">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li><li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging.">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat Med. 12, 354-360 (2006).</li><li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+malignant+phenotype+of+a+human+carcinoma+conditioned+by+growth+environment.">Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment.</a> Cell. 33, 323-333 (1983).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).</li><li>Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression+cloning+with+an+antimetastatic+monoclonal+antibody+identifies+a+tetraspanin+(PETA-3/CD151)+as+an+effector+of+human+tumor+cell+migration+and+metastasis.">Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis.</a> Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).</li><li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151.">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li><li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction.">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li></ol>

El CAM de pollo se ha utilizado durante décadas como un sistema modelo para estudiar diversos aspectos de la biología del cáncer y la progresión metastásica. Evaluación de las habilidades principio metastásico se han realizado en este modelo por una variedad de grupos, incluyendo el análisis de latencia (Ghiso Aguirre et al, 1999;. Ossowski y Reich, 1983), la remodelación de tejidos (Deryugina et al, 2005;. Hahn-Dantona . et al, 1999) y metástasis (Zijlstra et al, 2008;. Zij...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> 1X Dulbecco Eagle modificado (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco buffer fosfato salino (D-PBS) (1X), líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Tripsina, 0,05% (1X) con EDTA 4NA, líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Deportista nacedora </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> Estas incubadoras son algunos de los más fácilmente disponibles. Sin embargo, el vídeo se muestran los diferentes equipos. </td></tr><tr><td> Deportista incubadora </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Herramienta rotativa Dremel </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dremel ruedas de corte no. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Portable Ayuda pipeta </td><td> Pescador </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> Bastoncillos de algodón </td><td> Pescador </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> Los huevos fertilizados </td><td> Varios </td><td></td><td> Diferentes proveedores pueden usar muchos. Los huevos deben ser de aproximadamente 35-55 gramos. Las gallinas que establece que debe estar entre 36 y 55 semanas de edad. </td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Hausser Científico, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> De fibra óptica de microscopio iluminador </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25 calibre de la aguja </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Extract-N-Amp tejido PCR Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model

En las células de la metástasis del cáncer de difundir el tumor primario, invaden los tejidos circundantes, y se extendió a órganos distantes. La metástasis es un proceso complejo que puede involucrar a muchos tipos de tejido, los períodos de duración variable de tiempo, y con frecuencia se producen en lo profundo de los órganos, por lo que es difícil de investigar y cuantificar. Además, la eficacia del proceso de metástasis está influido por diversas etapas de la cascada metastásica lo que hace difícil evaluar la contribución de un solo aspecto de la conducta de las células tumorales. Como consecuencia de ello, los ensayos de metástasis se realiza con frecuencia en animales de experimentación para proporcionar un contexto necesariamente realista en el que para estudiar la metástasis. Desafortunadamente, estos modelos se complica aún más por su compleja fisiología. El embrión de pollo es un único modelo in vivo que supera muchas limitaciones para el estudio de la metástasis, debido a la accesibilidad de la membrana corioalantoidea (CAM), un bien vascularizado extra-embrionarios de tejido situado debajo de la cáscara del huevo que es receptivo a los xenoinjertos de células tumorales (figura 1). Por otra parte, desde el embrión de pollo es, naturalmente, inmunodeficientes, la CAM fácilmente compatible con el injerto de tejidos normales y tumorales. Lo más importante, la CAM aviar apoya exitosamente la mayoría de características de las células del cáncer, incluido el crecimiento, la invasión, la angiogénesis y la remodelación del microambiente. Esto hace que el modelo excepcional para la investigación de las vías que conducen a la metástasis del cáncer y para predecir la respuesta del cáncer metastásico de nuevas terapias potenciales. La detección de células diseminadas por especies específicas PCR Alu hace posible evaluar cuantitativamente la metástasis en órganos que son colonizados por tan sólo 25 células. Utilizando la línea Humanos epidermoide carcinoma de células (HEp3) que utilizan este modelo para analizar la metástasis espontánea de las células del cáncer a órganos distantes, como el hígado de pollo y de pulmón. Además, utilizando el protocolo de Alu-PCR se demuestra la sensibilidad y reproducibilidad de la prueba como una herramienta para analizar y cuantificar intravasation, el arresto, la extravasación y la colonización como elementos individuales de la metástasis.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model at JoVE.com

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

El uso de PCR cuantitativa, se demuestra cómo la bien establecida chica modelo CAM se puede utilizar para analizar cuantitativamente la metástasis de células tumorales humanas a órganos distantes.

Análisis cuantitativo de la metástasis del cáncer utilizando un modelo de embrión aviar

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

quantitative-analysis-of-cancer-metastasis-using-an-avian-embryo-model

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Cancer

SCIENTISTS IN ACTION

18.9K vistas.  Vanderbilt University. El uso de PCR cuantitativa, se demuestra cómo la bien establecida chica modelo CAM se puede utilizar para analizar cuantitativamente la metástasis de células tumorales humanas a órganos distantes.

Video: Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga murino

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Investigación

Medicina

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Visualización y detección cuantitativa de cáncer de piel utilizando imágenes térmica dinámica

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multimodal de imágenes de la angiogénesis en un modelo de rata desnuda de las metástasis óseas del cáncer de pecho utilizando imágenes de resonancia magnética, tomografía computarizada y la ecografía volumétrica

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Los modelos de metástasis en los huesos

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

La cuantificación de la intra-peritoneal del cáncer ovárico Metástasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...