Los autores desean agradecer a J. Kueper y Wittschier J. por su excelente asistencia técnica y el profesor de Ruebben generosamente proporcionaron el material tumoral.

Todos los equipos y reactivos para comprar estéril o tiene que ser calor o vapor esterilizado o esterilizado con EtOH al 70%. Los autores afirman que los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo (86/609/CEE), siguiendo las directrices de los NIH sobre el cuidado y uso de animales en los procedimientos experimentales y los reglamentos establecidos por el Comité Institucional la atención y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Duisburg-Essen (Alemania). Parte 1: La incubación de los huevos <ol><li> Los huevos fertilizados pueden ser almacenados a 13 º C durante un máximo de una semana. </li><li> Los huevos son incubados durante 72 horas, en posición horizontal en una incubadora con una bandeja de movimiento, la rotación de los huevos 12 veces al día continuamente. La humedad se mantiene a 60 - 62%, temperatura de incubación a 37,5 ° C. Nota: Antes de comenzar la incubación, la suciedad, las plumas y los excrementos son cuidadosamente de las cáscaras de huevo mecánicamente por secarla con toallas comunes, en zig-zag gris papel para las manos, que tienen un duro en lugar de una estructura de superficie blanda. Limpieza de los huevos con etanol u otro desinfectante, sin embargo, redujo significativamente la tasa de supervivencia de los embriones, independientemente de que el líquido utilizado. </li></ol> Parte 2: Ex ovo cultura <ol><li> Después de la incubación durante 72 horas, los huevos son retirados de la incubadora. Nota: Los huevos son incubados durante 72 horas debido a que - de acuerdo a nuestras experiencias - por razones desconocidas, pero de acuerdo con Auerbach et al1 etapas de desarrollo anteriores eran mucho más bajas tasas de supervivencia. En etapas posteriores de 72 horas el saco vitelino, que aún no está cubierto por la CAM se vuelve más delgada y tiende a adherirse a la cáscara del huevo líder (i) a pequeñas hemorragias en la zona de adherencia y (ii) la ruptura de la yema del saco membrana. Por lo tanto, el método presentado no es aplicable a los embriones de más de 72 horas. </li><li> La parte superior de los huevos, cuando el embrión se encuentra, está marcada por el lápiz desde el embrión resiste la rotación hasta cierto punto. </li><li> El huevo está en posición horizontal con la marca del lápiz en la parte superior y agrietadas en el borde de un 80 mm triangular barra de agitación magnética por la que se orientados perpendicularmente al eje longitudinal del huevo. Nota: Para una mejor sensación, no se debe utilizar guantes, pero las manos se deben desinfectar con un 70% EtOH. Es importante que la cáscara del huevo, así como la membrana del huevo se abrió. Fugas de clara de huevo es un signo seguro de que la membrana del huevo se ha perforado. </li><li> El huevo se mantiene cerca de la parte inferior de la placa de Petri para evitar escapes de clara de huevo. Nota: Durante el proceso de apertura inicial, es importante que la clara de huevo en la parte inferior de la placa de Petri todavía está conectado con el resto en el interior del huevo ya que esto da lugar a un vacío en el interior del huevo que contiene la yema de huevo con el embrión en la parte superior dentro de el huevo. El vacío se puede regular, ya sea por la presión del dedo, que controla la entrada de aire en el huevo o el huevo, levantando lo que aumenta la columna de la conexión es decir, la clara de huevo vacío. </li><li> Ejerciendo una suave presión con el meridiano que atraviesa la grieta y el ecuador del huevo con el pulgar y el dedo medio, es posible regular el vacío. El contenido del huevo puede ser transferida a la placa de Petri en buen estado, si el huevo con la yema de huevo se levanta suavemente y las dos mitades de la cáscara se separan cuidadosamente. El embrión y la yema de los barcos que se encuentran en la parte superior de la yema de un buen estado. Nota: Si la marca del lápiz no se mantiene en la parte superior, el embrión puede ser herido cuando agrietamiento de la cáscara. Si los huevos no estén agrietados o con la suficiente atención a los embriones tienen más de 72 horas (ver arriba), el saco vitelino se adhiere a la concha y se rompe con frecuencia. Lo mismo ocurre cuando la humedad de la incubadora es inferior al 60% o los huevos no se giran durante la incubación. </li><li> Ex ovo culturas se devuelven a la incubadora y se mantiene a 37,5 ° 38,2 ° C y una humedad del 60%. CO 2 y O 2 la oferta no es necesario si la incubadora no está cerrada herméticamente (rejilla de ventilación parcialmente abierta!) Y platos de Petri con separadores entre la tapa y el plato se utilizan. Nota: Movimiento de los embriones deben mantenerse a un mínimo durante los primeros días de incubación. Demasiada agitación en altas tasas de mortalidad. De incubación de 9 días en adelante, los embriones son menos sensibles a la agitación. Embriones muertos deben ser retirados inmediatamente para evitar infecciones. Si incubadoras de cultivo de células se utilizan, que están herméticamente cerrados, la oferta de O 2 es obligatoria para los embriones que no se muera. La humedad es esencial para la CAM no se sequen y si la temperatura de incubación es inferior a 37 ° C, los embriones se desarrollan con demasiada lentitud. </li></ol> Parte 3: Aplicación de sustancias para los ensayos de la angiogénesis <ol><li> Autoclave papeles doblados filtro (50,5 mm de diámetro) se perforan por una perforadora y se utiliza como material de apoyo (soporte) para las sustancias líquidas aplicadas a la medicina complementaria y alternativa. Nota: Casi cada material de soporte (ver tabla abajo) causó la irritación de la CAM, especialmente cuando se aplica antes del día de incubación de 10, ya que cambió la arquitectura CAM barco en desarrollo. Esto también incluye sustancias potencialmente inerte como el papel de hidroxietilcelulosa, esponjas de teflón (PTFE-pledgets), esponjas de colágeno, lámina de colágeno, una gasa estéril (hisopos), se desliza alrededor de la cubierta, y los anillos de silicona, lo que causó todos los resultados positivos falsos. Papel de filtro parecía causar el menor irritación y se utilizó por lo tanto, en nuestros ensayos. </li><li> Cuando la CAM se ha desarrollado plenamente, hasta 6 muestras diferentes se pueden aplicar y sus efectos se pueden comparar en una sola CAM. </li><li> Para evitar que se sequen las dosis filtros adicionales (3 mg angiotropina nativo) o de amortiguación (5 l de PBS) se debe volver a aplicarse cada día. </li><li> Desde el día 3 después de la aplicación, los vasos sanguíneos orientarse hacia las sustancias angiogénicas en los filtros, mientras que el patrón de los vasos sanguíneos que rodean los controles no se ha modificado. Nota: La CAM no debe confundirse con la yema de huevo-saco. La CAM es una estructura dinámica de desarrollo, mientras que el saco vitelino es estática con variaciones poco durante el desarrollo. En el desarrollo de tres días de la CAM en desarrollo puede ser reconocido por primera vez en el extremo caudal del embrión como una pequeña vesícula. Entre los días tres y diez días de la vesícula inicial se expande, creando un plegado de dos capas de membrana overgrowing el saco vitelino a un ritmo creciente. El lugar de aplicación debe estar a medio camino entre el embrión y el pliegue de la CAM (frontera) de otra manera el embrión dificulta la observación microscópica de los efectos de la luz transmitida. Por otra parte, el filtro con la sustancia angiogénica se internaliza cuando el CAM sigue creciendo. </li></ol> Parte 4: La inoculación de las células en la CAM 4.1.Preparation de las células <ol><li> Las células confluentes se transfieren del frasco de cultivo a tubos Falcon por el uso de una pipeta de plástico estéril 25 ml con una pipeta de ayuda. </li><li> Para estimar el número de células, 15 l de la suspensión celular se transfirió a una cámara de Neubauer y las células se cuentan manualmente con un microscopio. </li><li> Tubos Falcon se centrifugan durante 3 minutos a 1000 rpm a temperatura ambiente y se descarta el sobrenadante. </li><li> Para el seguimiento de células vivas, las células se diluyen con PBS a la concentración deseada (en este caso: 2x10 7 células / ml) y se tiñeron con, por ejemplo PKH26 (Sigma), un fluorescente de color rojo vivo la membrana celular kit de etiquetado, según el protocolo del fabricante. Las células son resuspendidas en medio de cultivo celular (preferentemente Dulbecco modificada de águila; DMEM) a la concentración deseada para la inyección (10 7 células / ml) o la inoculación (3x10 6 células / ml). Diferentes concentraciones de células se aplican las inyecciones contra la inoculación de acuerdo a las concentraciones ya publicados en la literatura 15-17 y nuestra experiencia. </li></ol> 4.2 La inoculación de las células en la CAM <ol><li> Anillos (~ 1 mm de espesor) se cortan de una punta de la pipeta de 1 ml o un catéter venoso periférico (CVP) del tubo por el uso de un bisturí y se aplica a la CAM de un ovo chica E6-E14 embrión ex cultivadas. Nota: Trate de no &quot;vio&quot; varias veces, pero para cortar la punta de la pipeta o catéter con un corte con un bisturí nuevo, muy fuerte para evitar los bordes afilados de los anillos resultantes. Revise los anillos bajo el microscopio en busca de bordes afilados como resultado de micro-fisuras. </li><li> Dependiendo del tamaño de los anillos de 20 l de 3x10 6 células / ml con pipeta las células en total en un anillo o como volúmenes divididos en múltiples anillos. Nota: En algunos casos trauma de la CAM por raspado suave es un pre-requisito, por ejemplo, para facilitar la inoculación de células de 17 y pulmonar de los injertos (ver más abajo). Sin embargo, si la traumatización de la CAM no se pretende ni se contraindica, por ejemplo, para los estudios sobre el potencial invasor de las células tumorales, los anillos no deben ser utilizados para la inoculación, pero las células se debe aplicar directamente como la aplicación de anillos o anillos se pueden inducir lesión micro . Si los anillos se utilizan, estos se deben cortar lo más fina posible para minimizar el peso y evitar la sangría de la CAM. </li></ol> Parte 5: inyección intravítrea de células <ol><li> Una jeringa Hamilton microlitro se enjuaga varias veces con EtOH al 70% y finalmente con PBS estéril. </li><li> La jeringa micro se llena con la suspensión celular preparada manchados o sin teñir (ver apartado 4.1). Nota: El sitio de la inyección debe ser cuidadosamente seleccionado, de no lesionar los vasos sanguíneos de las estructuras adyacentes CAM o del embrión (brain!) por sobre la penetración de la aguja. La inyección se debe realizar bajo un binocular de disección. </li><li> Bajo el control de microscopio, Con cuidado, pero rápidamente penetran en la CAM y las capas del ojo con la aguja de la jeringa y continuamente se inyectan de 10 a 20 máximo de suspensión de células l (preferentemente diluido en PBS) en el humor vítreo de los ovo embrión de pollo ex cultivadas. Nota: Si la CAM no puede ser penetrado con la aguja, puede ser removido en un sitio con pocos vasos sanguíneos o no de él con cuidado separando con dos pinzas. </li><li> La aguja debe permanecer 02.01 segundos en el ojo para evitar la pérdida de la suspensión de células inyectadas por fugas. </li></ol> Parte 6: Disección de esbozos de los miembros de pollo <ol><li> Los huevos son retirados de la incubadora después de 3 a 4 días de incubación (E3/E4 = Hamburguesa Hamilton (HH) stage18-23) </li><li> Los huevos están rotos en el borde de una barra de agitación magnética triangular y se transfieren a una placa de Petri (detalles: véase la Parte 2) y el embrión se diseca la yema de los vasos conectados mediante la reducción de un círculo con unas tijeras de primavera. </li><li> El embrión se transfiere a una nueva placa de Petri llena de frío, PBS estéril por el uso de una cuchara pequeña de drenaje y lavado por agitación tipo. </li><li> El embrión se transfiere a una pequeña placa de Petri llena con PBS estéril y libre de las membranas que rodean, cuidadosamente desgarrando con unas pinzas finas. </li><li> Esbozos de los miembros se separan por pinzas de microcirugía lo más cerca del cuerpo como sea posible, captar y transferir a la CAM de un ovo host de 8 a 10 días de edad, ex pollo cultivadas (ver procedimiento de injerto). </li></ol> Parte 7: Preparación de esbozos de los miembros del ratón <ol><li> Apareamientos vez embarazadas se establecen y la mañana del día en que se detecta un tapón vaginal en el apareamiento las hembras se designa 0 días de gestación. </li><li> La mujer embarazada se sacrificaron por dislocación cervical cuando el desarrollo de los embriones llegó el día embrionario (E) 10 a 13 y fija en una tabla de cera. </li><li> La pared abdominal se humedece con EtOH al 70%, corte a lo largo de la línea media y los colgajos de piel se fijan lateralmente por alfileres. </li><li> Los dos cuernos del útero se extirpan del abdomen, individual y se transfiere a un recipiente con PBS frío. </li><li> Los embriones se separan, se transfirió a una placa de Petri y la pared del útero y las membranas embrionarias son retiradas por el uso de fórceps. </li><li> Esbozos de los miembros son cortados por el uso de tijeras de primavera o separado por unas pinzas finas tan cerca del cuerpo como sea posible, captar y transferir a la CAM de 8 a 10 días de edad in ovo de pollo cultivados ex anfitrión (ver procedimiento de injerto). </li></ol> Parte 8: Colección de muestras de tumores <ol><li> Biopsias de los tumores se recogen en 2 ml tubos Eppendorf llena con un medio de cultivo de células del tumor-específica (en este medio de Leibovitz) y se mantiene a temperatura ambiente. </li><li> Biopsias de los tumores se cortan en pedazos por 1-2 mm3 bisturí estéril. Nota: Si las muestras de tumor eran demasiado pequeños, es posible que no se adhieren a la CAM, si eran demasiado grandes, la CAM podría estar lesionado y el embrión podría morir. </li><li> Una pieza de la base de la muestra de biopsia se injerta en la CAM de 8 a 10 días de edad ovo pollo anfitrión cultivadas ex (ver procedimiento de injerto). Nota: Toma de material de la superficie de la biopsia aumenta el riesgo de contaminación con el músculo o tejido conectivo. </li></ol> Parte 9: procedimiento de injerto <ol><li> Para el injerto de yemas de las extremidades o las muestras de tumor, el completamente desarrollado CAM de 8 a 10 días de edad embriones de pollo cultivados ex ovo se utiliza. </li><li> Los injertos son muy bien situado en la medicina complementaria y alternativa cerca de una bifurcación Y de un vaso sanguíneo. </li><li> En el sitio de aplicación deseada, la CAM es selectiva traumatizados por fuera raspado suave (pinzas) de la parte superior peridermal de la capa epitelial de matrimonio, dejando la capa basal intacta. Nota: es esencial para evitar el sangrado o ruptura de los capilares visibles. </li><li> El injerto es transferida a la CAM con un mínimo de PBS adjunto. Dependiendo de la prótesis, puede ser colocado una o dos veces en un sitio de la CAM, donde no definitiva injerto se destina a eliminar exceso de PBS y, finalmente, injertados en el sitio de CAM preparado traumatizados. </li><li> El injerto se sujeta por pinzas finas y capas en la CAM. Dependiendo de la sensibilidad del injerto, la presión de la luz podría ser aplicado (no apto para esbozos de los miembros) para maniobrar el injerto en una hendidura que resulta de la CAM (apropiado para muestras de tumor). Nota: Como el sistema inmunológico de pollo se desarrolla en el día embrionario (E) 18, ex ovo culturas xenoinjertos no debe prolongarse más allá del E17 como los embriones de pollo de acogida con frecuencia mueren. Es importante tener CAM dispone de sede, respectivamente ovo embriones de pollo cultivados ex, para coincidir con una fuente de tejido de un donante de su elección. </li></ol> Parte 10: Re-injerto <ol><li> El embrión de pollo de acogida es muerto por decapitación. </li><li> La CAM conel injerto unido se elimina mediante un corte circular con tijeras con punta y se transfieren a una placa de Petri llena de PBS. </li><li> CAM excesiva se corta con tijeras el injerto de primavera a excepción del sitio de unión anterior. </li><li> En el caso de las muestras de tumor más grande, el injerto se corta en mitades o en varios pedazos más pequeños y re-injertados con el filo hacia el CAM de nuevo el segundo host. </li></ol> Parte 11: Resultados de Representante <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Caparazón de pollo cultura Embriones de pollo de las diferentes etapas de desarrollo cultivadas ex ovo en placas de Petri. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Ex ensayo de angiogénesis in ovo CAM Fecundados los huevos de gallina se incubaron horizontalmente a 37 ° C y una humedad de 60 - 62% y agrietada en placas de Petri en el día embrionario 4 (E4). Se continuó la incubación en las mismas condiciones. E10, papeles filtro estéril (5,5 mm de diámetro) en capas en la parte superior de la CAM y empapado, ya sea con 5 l de PBS o 3 mg nativos angiotropin6. Capilares mostró la alineación obvia hacia el angiotropina filtro de papel empapado en E14. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Ex ovo el injerto de yemas de las extremidades Esbozos de los miembros de la chica (E3/E4) y el ratón (E13) se injerta en la CAM de las culturas de pollo sin caparazón. Los vasos sanguíneos de la CAM entró en la yemas de las extremidades después de dos días. El desarrollo de los esbozos de los miembros continuaron en estas culturas ex ovo llegando a una etapa en la falange dos de pollo y la visualización de la reducción de las webs interdigital en esbozos de los miembros murino. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Inoculación ex ovo de la muestra de tumor Una muestra de la biopsia de carcinoma de vejiga se inoculó en la CAM de un ovo de pollo de 10 días de edad, ex embriones cultivados. Después de dos días en la cultura, el espécimen estaba conectado a la vasculatura CAM y después de 7 días, múltiples vasos sanguíneos que entran el injerto se observaron.

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Innovadora o simplemente un protocolo de pollo cultura? Con el ex protocolos de cultivo de concha menos 1.4 la tasa de supervivencia total de los embriones de pollo fueron bajos, por ejemplo, ca. 30% 1. El protocolo ex refinada cultura ovo descrito en este artículo de vídeo, por el contrario, permite que las tasas de supervivencia superiores al 50%. En comparación con los clásicos en las culturas ovo cultura ex ovo de emb...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fertilized Eggs</td>
<td>Animal</td>
<td>S&ouml;ries Trockels, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator Type 3000 with rotating egg tray</td>
<td>Tools</td>
<td>Siepmann GmbH Germany</td>
<td>9503</td>
<td>Maintain at 37&deg;C with relative humidity set above 60%</td>
</tr>
<tr>
<td>Egg incubator BSS 160</td>
<td>Tools</td>
<td>Grumbach, Germany</td>
<td>8101</td>
<td>Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile
</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco's modified eagle's medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 6429</td>
<td>DMEM culture medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Leibovitz's L-15 Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31415-029</td>
<td>here: collection medium for tumor samples</td>
</tr>
<tr>
<td>Tumor cell -specific medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz's Medium or Dulbecco's modified eagle's medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 &mu;M insulin</td>
</tr>
<tr>
<td>70% EtOH</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic stir bar, triangled 80 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>442-0391</td>
<td>A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5 </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors, straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine Iris scissors, straight</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14094-11</td>
<td>Use to cut our the CAM</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>microliter syringe 1702 TLLX, 25 &mu;l</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton</td>
<td>80222</td>
<td>Use for injection into the vitreous</td>
</tr>
<tr>
<td>Hamilton 33-G needle (15 mm)</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18073-15</td>
<td>Use for injection into the vitreous</td>
</tr>
<tr>
<td>Sterile scalpels</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use for dissecting tumor samples</td>
</tr>
<tr>
<td>Small drain spoon</td>
<td>Tool</td>
<td>Geuder, Germany</td>
<td>15758</td>
<td>Use to transfer of small chick embryos</td>
</tr>
<tr>
<td>Wax board with fixing pins</td>
<td>Tool</td>
<td>Self made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use to fix of animals for dissection</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes 60 x 15 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Greiner</td>
<td>628102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petri dishes 92 x 16 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>82.1472</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Petri dish 100 x 20 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Greiner</td>
<td>664160</td>
<td>extra deep, with spacers for ventilation</td>
</tr>
<tr>
<td>Beaker</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>300-600 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>FALCON tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>15 ml and 50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1.5 ml and 2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml pipette tips</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use to cut plastic rings for application of substances / cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Peripheral venous catheter (PVL)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viggo&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes and tips</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf / Abimed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter</td>
<td>Tool</td>
<td>Schleicher &amp; Schuell</td>
<td>311643</td>
<td>Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper</td>
</tr>
<tr>
<td>PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>santec-medical</td>
<td>REF 277, LOT 832/511-1</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Kollidon 17 PF</td>
<td>Reagent</td>
<td>BASF</td>
<td>S30200</td>
<td>mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagen Biomatrix TissuDura</td>
<td>Tool</td>
<td>Baxter Healthcare S.A.</td>
<td>REF B2246000999999</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Round glass cover slips, 11 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Assistent Germany</td>
<td>1001/0011</td>
<td>Carrier; causes false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine Collagen Sponge</td>
<td>Tool</td>
<td>Wyeth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Resodont Absorbable Collagen Membrane</td>
<td>Tool</td>
<td>Resorba Woundcare Germany</td>
<td>LOT 280303</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-Woven Swabs</td>
<td>Tool</td>
<td>Fink &amp; Walter GmbH</td>
<td>REF 328132</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

chick ex ovo culture and ex ovo cam assay: how it really works

Los huevos de gallina en la primera fase de cría se encuentran entre in vitro e in vivo en los sistemas y proporcionar un entorno de pruebas vasculares no sólo para estudiar la angiogénesis, sino también para estudiar la génesis tumoral. Después de la membrana corioalantoidea de pollo (CAM) ha desarrollado, la red de vasos sanguíneos se puede acceder fácilmente, manipulado y observado y por lo tanto proporciona un ajuste óptimo para los ensayos de la angiogénesis. Dado que el sistema linfático no se desarrolla completamente hasta las últimas etapas de incubación, el embrión de pollo sirve como anfitrión natural inmunodeficientes capaz de sostener los tejidos injertados y las células sin las restricciones propias de cada especie. Además de fomentar el desarrollo de asignación y xenoinjertos, la sangre CAM red de vasos proporciona un entorno único de apoyo para intravasation de las células tumorales, la difusión, y la detención vascular y un depósito donde las células detenidas extravasado para formar micro focos metastásicos. Con fines experimentales, en la mayoría de los estudios recientes de la CAM fue expuesto por el corte de una ventana a través de la cáscara del huevo y los experimentos se llevaron a cabo in ovo, dando lugar a importantes limitaciones en la accesibilidad de la CAM y las posibilidades de observación y documentación fotográfica de los efectos. Cuando caparazón culturas del embrión de pollo se utilizaron 4.1, no se proporcionaron detalles del experimento y, si se ha publicado en todos, las tasas de supervivencia de estas culturas eran bajos. Hemos perfeccionado el método de cultivo ex ovo de embriones de pollo de manera significativa mediante la introducción de una extrusión racionalmente controlado el contenido del huevo. Estas culturas ex ovo mejorar la accesibilidad de la CAM de embriones de pollo y, lo que permite fácil en la documentación vivo de los efectos y facilitar la manipulación experimental del embrión. Esto permite la aplicación con éxito a un gran número de preguntas de carácter científico: (1) Como un ensayo de angiogénesis mejora de 5,6, (2) un montaje experimental para facilitar las inyecciones en el humor vítreo del ojo del embrión de pollo 7-9, (3) como un entorno de prueba para la difusión y intravasation de la dispersión de las células tumorales de líneas celulares establecidas inoculados en la CAM 10-12, (4) como un sistema mejorado para mantener el éxito del trasplante y la cultura de los esbozos de los miembros de pollo y ratones, así como 13 (5 ) para el injerto, propagación y re-injerto de tejido de tumores sólidos primarios obtenidos de las biopsias en la superficie de la CAM 14. En este artículo se describe el vídeo establecimiento de una cultura refinada chica ex ovo y el ensayo de CAM con tasas de supervivencia superiores al 50%. Además le ofrecemos una demostración paso a paso de la aplicación exitosa de la cultura ovo ex de un gran número de aplicaciones científicas. Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, y Gustmann Sebastián contribuyeron igualmente a este estudio.

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Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

La chica membrana corioalantoidea (CAM) es un entorno único, apoyo la cultura, naturalmente, inmunodeficientes para estudiar la angiogénesis y la tumorigénesis. Este artículo video demuestra las diferentes etapas de pollo<em&gt; Ex ovo</em&gt; Cultura, aplicación de sustancias potencialmente angiogénicos y la inoculación exitosa de las células tumorales y tejidos en la superficie de la CAM.

Pollo Ex ovo Cultura y Ex ovo CAM Ensayo: cómo funciona realmente

Chicken eggs in the early phase of breeding are between in vitro and in vivo systems and provide a vascular test environment not only to study ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

48.5K vistas.  University of Duisburg-Essen. La chica membrana corioalantoidea (CAM) es un entorno único, apoyo la cultura, naturalmente, inmunodeficientes para estudiar la angiogénesis y la tumorigénesis. Este artículo video demuestra las diferentes etapas de pollo Ex ovo Cultura, aplicación de sustancias potencialmente angiogénicos y la inoculación exitosa de las células tumorales y tejidos en la superficie de la CAM.

Video: Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

En Electroporations Ovo de embriones de pollo HH Etapa 10

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Investigación

Biología

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

Descifrar Caminos axonal de los grupos definidos genéticamente las neuronas en el tubo neural del polluelo Utilizando In ovo La electroporación

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Un Ex-ovo</emPollo> Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo Cultura de células humanas primarias epiteliales del tubo de Falopio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

En electroporación in ovo en la retina de embriones de pollo

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Transferencia de genes en embriones de pollo por los mayores<em&gt; Ex ovo</em&gt; La electroporación

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura de embriones de ratón con la piel y en vivo de imágenes de melanoblasto Migración

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.