Este protocolo permite evaluar el mecanismo de injerto de islotes en tejido adiposo blanco. La principal ventaja de este método de trasplante de islotes cubiertos de grasa es que es técnicamente fácil de replicar. El método se puede aplicar a otros modelos de enfermedad.
Por ejemplo, se puede utilizar para crear un modelo de ratón de cáncer. Demostrando el procedimiento estará Naoaki Sakata, profesor asociado de la Universidad de Fukuoka. Bajo un microscopio de disección, use una micropipeta P 200 para eliminar cualquier componente adicional de los islotes de las digestiones del páncreas, incluidos los tejidos acinares y fibrosos.
Luego use un colador celular para filtrar células acinares individuales. Transfiera los islotes filtrados a una nueva placa de cultivo que contenga el medio de cultivo apropiado o la solución tampón complementada con suero bovino o albúmina, y agite el plato para colocar los islotes en el centro. Con una micropipeta P 200, coloque los islotes individuales en un tubo de recolección apropiado.
Coloque un nuevo filtro celular de 40 micrómetros encima de un tubo de plástico de 50 mililitros. Utilice una pipeta de 1000 microlitros para añadir los islotes al colador para separar los islotes y las células acinares individuales. Use fórceps para invertir el colador en una nueva placa de cultivo no tratada de 60 o 100 mililitros que contenga medio de cultivo o una solución tampón apropiada, complementada con suero bovino o albúmina.
Use medio fresco o amortiguador para enjuagar los islotes en una nueva placa de cultivo, luego agregue suficiente medio o tampón a la placa de cultivo para alcanzar un volumen total de aproximadamente 20 mililitros. Cuente los islotes bajo un microscopio y divida el número de islotes por igual entre tubos centrífugos de plástico individuales de 1,5 mililitros de acuerdo con el número de animales donantes. Centrifugar los islotes a 2, 100 G durante un minuto a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
Alrededor de 20 a 30 microlitros de solución residual normalmente permanecerán en el tubo. Después de quitar el vello del abdomen para prevenir la infección, coloque al ratón en posición supina. Después de desinfectar el abdomen y la región inguinal, incide la piel en el área mediana inferior, creando una incisión en la piel de aproximadamente dos centímetros de longitud.
Sujete la pared abdominal izquierda con fórceps o retractores y tire del tejido hacia el lado izquierdo del ratón para asegurar el campo quirúrgico. Use un hisopo de algodón para movilizar el intestino delgado y grueso hacia el lado derecho del ratón. El tejido adiposo blanco epidérmico izquierdo en la cavidad abdominal se encuentra en el área inguinal izquierda.
Movilice el tejido adiposo blanco epidérmico y el testículo izquierdo hacia el exterior del abdomen y estire el tejido. Utilice una micropipeta P 200 para recoger todo el volumen de islotes de un tubo de 1,5 mililitros, teniendo cuidado de que no queden islotes en el tubo después de la recogida. Permita que los islotes recogidos se asienten en la punta de la pipeta por gravedad.
Coloque la punta de la micropipeta ligeramente sobre el tejido adiposo distendido, teniendo cuidado de evitar el lavado excesivo del medio o tampón en la punta. Siembra cuidadosamente los islotes en el tejido. Después de la siembra, confirme la colocación correcta de los islotes bajo un microscopio de disección.
Cubra los islotes con el tejido adiposo blanco epidérmico, luego coloque el testículo izquierdo debajo del tejido adiposo blanco episomal y devuelva los tejidos a la cavidad intraperitoneal. Cierre la piel en dos capas con una sutura 4-o. Cuando termine, coloque el mouse bajo una lámpara de calor y monitoréelo hasta que se recupere por completo.
Para comparar la eficacia del trasplante del trasplante de islotes cubiertos de grasa con la del trasplante intraperitoneal de islotes, se implantó el mismo número de islotes en el peritoneo en el espacio paracólico izquierdo de los animales diabéticos receptores de control. Se observó que los niveles de glucosa en sangre de ratones con trasplante de islotes cubiertos de grasa disminuyeron gradual y significativamente en comparación con los ratones trasplantados con islotes intraperitoneales. La prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal se realizó un mes después del trasplante.
La glucosa en sangre en ratones con trasplante de islotes cubiertos de grasa se mantuvo en niveles más bajos que los observados en ratones trasplantados con islotes intraperitoneales. Se utilizó el examen histológico para evaluar el injerto de islotes en el tejido adiposo blanco epidérmico. En animales receptores de trasplante de islotes cubiertos de grasa, la tinción de hematoxilina eoceno reveló la presencia de islotes dentro del tejido adiposo blanco epidérmico.
Además, la tinción de anticuerpos conjugados con fluorescencia de islotes positivos para insulina facilitó la detección de microvasos positivos para el factor von Willebrand dentro del tejido adiposo blanco epidérmico de todos los ratones receptores. Para tener éxito con este procedimiento, asegúrese de permitir que los islotes se asienten completamente en la punta de la pipeta y siembrarlos en el tejido adiposo sin derramarse.
