Los neutrófilos son células diferenciadas terminalmente, y actualmente no hay líneas celulares para recapitular completamente la biología de los neutrófilos. Por lo tanto, es necesario obtener neutrófilos puros, inactivados, sanos y frescos para estudiar su biología. Este método de actualización combina gradiente de densidad, sedimentación, lisis suave para obtener una preparación neutrofílica pura.
Es fácil de configurar, requiere un equipo simple y poca práctica. El aspecto técnico, como las capas de gradiente, de este método requerirá algo de práctica para dominar, pero una vez que el gradiente se perfecciona, los otros pasos deberían ser muy fáciles. Comience por esterilizar la capa buffy, el embalaje y la campana laminar.
Luego agregue 10 mililitros de sangre en un tubo de 50 mililitros. Para diluir la sangre para un limpiador de gradiente, agregue 5% FBS / HBSS y maquille el volumen hasta 35 mililitros. Después de cerrar la tapa, invierta el tubo varias veces para mezclarlo y luego mantenga el tubo boca abajo para obtener el fondo desprovisto de glóbulos rojos.
Agregue 10 mililitros del medio de gradiente de densidad directamente debajo de la sangre, asegurando que el medio y la sangre no se mezclen y la interfaz permanezca nítida. Gire el tubo a 400 veces g durante 30 minutos a temperatura ambiente, asegurándose de desactivar el freno. Después de girar, observe el gradiente separado en una capa superior de plasma sérico, un anillo blanco medio de células mononucleares de sangre periférica, una capa media de gradiente de densidad turbia y un gránulo inferior que consiste en una banda de neutrófilos delgada blanca en la parte superior de los glóbulos rojos.
Para eliminar el PBMC, emerja la pipeta de succión directamente en la capa de PBMC y aspira por completo mientras la capa de plasma sérico disminuye a medida que se retira el anillo. Raspe el lado del tubo con la pipeta de succión para maximizar la eliminación del PBMC. Retire con cuidado la capa media del gradiente de densidad turbia entre el anillo PBMC y el pellet de neutrófilos/glóbulos rojos.
Para la sedimentación de eritrocitos, use una pipeta de 10 mililitros para transferir el pellet de neutrófilos /glóbulos rojos a un tubo limpio. Luego agregue 5% FBS / HBSS a un volumen final de 25 mililitros. Agregue directamente 25 mililitros de la solución precalenada que contiene 3% de dextrano / 0.9% NaCl en agua en el tubo y mezcle suavemente por inversión.
Coloque el tubo sobre una superficie nivelada y no vibratoria durante 15 minutos. Después de colocar el tubo de nuevo en la campana, sumerja ligeramente la pipeta en el líquido y recoja aproximadamente 30 mililitros de la capa superior siguiendo la superficie del líquido hacia abajo. Gire el tubo para obtener un pellet rojo sin partículas flotantes en el medio.
Para la lisis del rbC residual, aspire suavemente el sobrenadante sin interrumpir el pellet. Agregue 25 milímetros de agua ultrapura estéril directamente en el tubo y mezcle suavemente invirtiendo el tubo durante 28 segundos para lisar el rbC. Luego, agregue inmediatamente 25 mililitros de solución estéril de NaCl al 1.8% preparada en agua en el tubo y devuelva la solución a las condiciones isotónicas mediante una mezcla suave.
Gire el tubo a 200 veces g durante tres a cinco minutos con un freno bajo para minimizar la sedimentación de glóbulos rojos y plaquetas con neutrófilos. Para resuspedar el pellet de neutrófilos blancos, agregue directamente el medio de cultivo sobre el pellet, pero no pipete hacia arriba y hacia abajo. A continuación, balancee el tubo horizontalmente de lado a lado para minimizar la activación celular.
Si se observa agregación o aglutinamiento celular, filtre la suspensión celular a través de una malla de 70 micrómetros para descartar los neutrófilos agrupados. Para evaluar la calidad de la preparación aislada de neutrófilos, tiñe las células con marcadores específicos para neutrófilos, eosinófilos y un marcador de activación. Después de adquirir 20, 000 células por citometría de flujo, analice la pureza y activación celular utilizando las estrategias de cierre y determine la viabilidad celular utilizando yoduro de anexina V / propidio como se describe en el manuscrito de texto.
El gradiente de densidad con una baja velocidad produjo neutrófilos con más pureza, mientras que una alta velocidad resultó en un mayor rendimiento a expensas de la pureza. Utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia, la distribución celular por sí sola proporcionó una estimación de la calidad del aislamiento celular, pero se debe preferir el uso de marcadores celulares específicos. Las poblaciones celulares contaminantes identificadas fueron monocitos, linfocitos y eosinófilos.
El enorme rendimiento de neutrófilos se logró utilizando este protocolo. Se evaluó la expresión de CD62L. La intensidad fluorescente media para CD62L disminuyó en las células de control positivas, lo que indica desprendimiento de CD62L y activación de neutrófilos.
La salud de los neutrófilos debe evaluarse antes de realizar el ensayo, ya que los neutrófilos tienen una vida media relativamente corta y la activación acorta aún más la vida. Después de la purificación de neutrófilos utilizando el gradiente de densidad y microperlas comerciales, las células se cultivaron durante 24 horas y la supervivencia celular se analizó mediante citometría de flujo. La cuantificación de células viables indicó que la purificación del gradiente de densidad resultó en más células viables después de 24 horas que la purificación utilizando un kit.
Es importante que los pasos de estratificación y centrifugación del gradiente se realicen lo mejor posible, ya que tendrá un gran impacto en la calidad de la preparación. Se pueden realizar experimentos in vitro y ensayos bioquímicos después de este procedimiento. Además, la selección negativa podría realizarse si se requieren células ultrapuras como en los experimentos de expresión de citoquinas y proteínas.
