La microglía derivada de iPS representa una fuente biológicamente relevante de microglía humana para la experimentación in vitro, y es una herramienta importante para investigar la biología de la microglía en la salud y la enfermedad. Presentamos un protocolo simple de diferenciación de microglia que requiere un uso mínimo de factores de crecimiento y logra una alta pureza y rendimiento. Además, demostramos un ensayo de fagocitosis completamente humanizado.
Las células similares a la microglía derivadas de iPSC son muy sensibles a la evaporación de los medios. Debe evitar usar los pozos en la esquina de la placa de cultivo celular y llenar todos los pozos vacíos con agua para mejorar la supervivencia. Una vez que las células madre pluripotentes inducidas, o iPSC, hayan alcanzado el 80% de confluencia, disocie las colonias lavando con un mililitro de DPBS y agregando un mililitro de un reactivo de disociación durante dos minutos a 37 grados centígrados.
Desaloje las colonias usando un elevador de células raspando varias veces para crear una suspensión de una sola célula. Recoja la suspensión y transfiérala a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga nueve mililitros de DPBS. Luego centrifugar las células a 500 veces g durante un minuto, quitar el sobrenadante, y resuspender en un mililitro del cuerpo embrioide, o EB, medio.
Tome 10 microlitros de células y diluya una o dos con azul de tripano. Cuente las células en un hemocitómetro y, según el recuento de células, diluya el stock celular hasta una dilución final de 10, 000 células por 100 microlitros. Para las células de recubrimiento, agregue 100 microlitros de las células diluidas por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo de baja adherencia.
Centrifugar la placa a 125 veces g durante tres minutos, e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro días. El segundo día, utilizando una pipeta multicanal, sustituya el antiguo medio semiEB por un medio nuevo. Para generar precursores primitivos de macrófagos, o PMP, cubra los pocillos de una placa de seis pocillos agregando un mililitro de solución de recubrimiento Matrigel helada.
Luego incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos horas, o durante la noche. En el cuarto día de diferenciación de EB, utilizando una punta de pipeta de un mililitro, transfiera los EB a los pocillos recubiertos de Matrigel. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para desalojar los EB del pozo.
Luego mantenga la placa inclinada para permitir que los EB se asienten en el borde del pozo. Una vez que todos los EB se hayan asentado, pipetear suavemente y reemplazar el medio viejo, manteniendo el EB en el borde del pozo con tres mililitros de medio completo PMP recién preparado. Distribuya uniformemente las celdas en los pocillos arrastrando manualmente la placa de lado a lado y de atrás hacia adelante.
Luego incube la placa durante siete días para permitir que los EB se adhieran al fondo del pozo. Después de siete días, inspeccione los EB bajo un microscopio de campo de luz con un aumento cuatro veces mayor para asegurarse de que estén conectados al fondo de los pozos. Realice un cambio de medio medio, y el día 21, reemplace el medio completo con tres mililitros de medio completo PMP.
El día 28, busque células redondas denominadas PMP en el sobrenadante. A continuación, recoja el medio que contiene los PMP utilizando una pipeta de 10 mililitros y un pipeteo automático sin perturbar los EB. Transfiera los PMP en el medio a un tubo cónico de 15 mililitros.
Centrifugar los PMP recolectados a 200 veces g durante cuatro minutos y aspirar el sobrenadante antes de volver a suspenderlos en uno o dos mililitros de células similares a la microglía, o medio basal IMG. Luego cuente las células en el hemocitómetro como se describió anteriormente. Centrifugar el resto de las células y diluir las PMP a la concentración deseada.
Luego coloque las células en placa a una densidad de 10 a la quinta células por centímetro cuadrado en placas tratadas con cultivo celular utilizando un medio completo IMG recién preparado. Para el ensayo de fagocitosis de células vivas, placa de 20 a 30 veces 10 a la cuarta PMP en una placa de 96 pocillos y 100 microlitros de IMG completa el medio y siga el proceso de diferenciación durante 10 días. El día del ensayo, retire 40 microlitros de medio por pocillo y agregue 10 microlitros de la solución de tinción nuclear.
Incubar el plato durante dos horas. Descongele los sinaptosomas etiquetados en hielo y sonicar suavemente con un sonicador de agua durante un minuto. Una vez más, coloque inmediatamente los sinaptosomas en hielo.
Diluir los sinaptosomas marcados en medio completo IMG a un microlitro de sinaptosomas por 50 microlitros de medio. Para el control negativo, prepare 60 micromolares de citocalasina D en medio completo IMG para inhibir la polimerización de actina y, por lo tanto, la fagocitosis. Luego agregue 10 microlitros de esta solución a cada pocillo para una concentración final de 10 micromolares e incube durante 30 minutos.
Retire la placa de la incubadora e incube a 10 grados centígrados durante 10 minutos. Mantenga la placa en hielo y agregue 50 microlitros de medio que contenga sinaptosomas. Centrifugar la placa a 270 veces g durante tres minutos a 10 grados centígrados, y mantener la placa en hielo hasta la adquisición de imágenes.
Inserte la placa en un lector de imágenes de células vivas y seleccione los pocillos que se analizarán. A continuación, seleccione un objetivo 20X. A continuación, ajuste el enfoque, el diodo emisor de luz o LED, la intensidad, el tiempo de integración y la ganancia de los canales azul y de campo brillante.
La fluorescencia del sinaptosoma debe ser insignificante en el punto de tiempo inicial. Seleccione el número de fichas individuales que se adquirirán en un montaje por pozo. Adquiera 16 baldosas en el centro del pozo, obteniendo imágenes de aproximadamente el 5% del área total del pozo.
Ajuste la temperatura a 37 grados centígrados y el intervalo de tiempo deseado para la obtención de imágenes. A continuación, abra el software de análisis. Luego abra el experimento que contiene las imágenes y haga clic en el icono Reducción de datos.
En el menú, seleccione Costura de imágenes en Procesamiento de imágenes para crear una imagen completa a partir de los mosaicos individuales de cuatro por cuatro en el montaje con los parámetros descritos en el manuscrito de texto. Defina un umbral de intensidad utilizando los canales DAPI y RFP para estas imágenes. Abra una imagen y haga clic en Analizar.
En Análisis, seleccione Análisis celular y, en Canal de detección, elija una imagen cosida en los canales DAPI o RFP. A continuación, vaya a la pestaña Máscara y recuento primarios y establezca un valor de umbral y valores de tamaño de objeto que seleccionen correctamente los núcleos celulares en el canal DAPI o la señal sinaptosómica en el canal RFP. Para contar el número de núcleos, vaya al menú Reducción de datos y, en Análisis de imágenes, seleccione Análisis celular.
Nuevamente, vaya a la pestaña Máscara primaria y conteo, y en Canal, seleccione las imágenes cosidas DAPI y use los parámetros descritos en el manuscrito de texto. A continuación, vaya a la pestaña Métricas calculadas y seleccione Recuento de celdas. Luego, para obtener el área de la señal del sinaptosoma, vaya al menú Reducción de datos y, en Análisis, seleccione Análisis celular.
Nuevamente, vaya a la pestaña Máscara y recuento primarios y, en Canal, seleccione imágenes cosidas RFP y use los parámetros detallados en el manuscrito de texto. A continuación, vaya a la pestaña Métricas calculadas y seleccione Área de suma de objetos. En la pestaña Reducción de datos, haga clic en Aceptar para permitir que el software analice todas las imágenes adquiridas.
Una vez analizadas las imágenes, exporte los valores Área de suma de objetos y Recuento de celdas para cada punto de tiempo. A continuación, divida el área de suma de objetos por el recuento de celdas para calcular el área normalizada por punto de tiempo. Si compara múltiples tratamientos o genotipos, calcule el índice de fagocitosis utilizando la ecuación dada.
Las iPSCs indiferenciadas muestran una morfología de colonia compacta con bordes bien definidos. Las iPSC disociadas formaron agregados esféricos denominados EB, y crecen en tamaño hasta el cuarto día de diferenciación. Cuando los EB están chapados para la generación de PMP, se adhieren a las placas recubiertas de Matrigel, y una capa de células se extiende y rodea los agregados esféricos.
En el día 28, las células redondas con una gran proporción de citoplasma a núcleo aparecen en la suspensión. Se recomienda encarecidamente cultivar iPSCs en placas recubiertas de Laminin 521 en lugar de Matrigel, debido al mayor rendimiento de PMP en placas recubiertas de Laminin 521. Después de la exposición de PMP al medio IMG, las células adquieren una morfología similar a la microglía con un pequeño citoplasma en presencia de procesos alargados.
Además, la identidad de la microglía se verificó mediante tinción inmunofluorescente. Típicamente, más del 95% de las células expresan IB1 y aproximadamente el 90% de las células expresan P2RY12 y TMEM119. El análisis de Western blot confirmó que iPSC derivaba neuronas motoras inferiores para los marcadores sinápticos expresados por los sinaptosomas humanos, la sinaptofisina y la proteína de densidad postsináptica 95.
En control en comparación con el punto de tiempo inicial, a las 10 horas, la señal fluorescente roja era robusta, ya que la mayoría de los sinaptosomas habían sido engullidos, y estaban localizados en compartimentos intracelulares ácidos. En los IMG tratados con citocalasina D, una fuerte reducción de la señal roja durante cero y 10 horas indicó que la señal detectada resulta de eventos fagocíticos. El área de sinaptosomas engullidos aumentó con el tiempo hasta las 16 horas.
Sin embargo, el área de señal roja de las células tratadas con citocalasina D no aumentó con el tiempo. Las células similares a la microglía derivadas de iPS se pueden usar para diversas aplicaciones, incluida la fagocitosis y la respuesta inflamatoria en el estudio de enfermedades neurodegenerativas y del desarrollo neurológico.
