Este protocolo describe una técnica sencilla que se puede utilizar para detectar la presencia y medir la longitud de los glicosaminoglicanos, que son moléculas de importancia cada vez más reconocida para muchos procesos biológicos. Esta técnica es fácilmente adaptable a la mayoría de los laboratorios de ciencias de la vida. Las técnicas glucómicas comparables a menudo requieren equipos y experiencia que solo se encuentran en los laboratorios de investigación de glicoquímica.
Esta técnica puede ser especialmente útil para los investigadores que están interesados en estudiar el glicocáliz, una capa de polisacáridos que recubre las superficies endotelial y epitelial del cuerpo humano. Comience colocando un cassette vacío en el tanque PAGE. Funde un gel de resolución mezclando 10 mililitros de solución de gel de resolución con 60 microlitros de persulfato de amonio 10% en un tubo de 15 mililitros.
Luego agregue 10 microlitros de TEMED. Invierta el tubo suavemente dos o tres veces. Agregue rápidamente 10 mililitros de la solución de gel de poliacrilamida activada al cassette usando una pipeta.
Superponga con dos mililitros de agua filtrada desionizada y permita que el gel de resolución polimerice durante 30 minutos. Después de que el gel de resolución se haya polimerizado por completo, deseche el agua superpuesta. Fundir el gel de apilamiento mezclando tres mililitros de solución de gel de apilamiento con 90 microlitros de persulfato de amonio 10% recién preparado en un tubo de 15 mililitros.
Luego agregue tres microlitros de TEMED e invierta el tubo suavemente de dos a tres veces. Use una pipeta para agregar rápidamente la solución de gel de apilamiento sobre el gel de resolución solidificado hasta que el cassette se llene hasta el borde. Inserte completamente el peine incluido con el cassette de gel de poliacrilamida vacío y permita que el gel de apilamiento polimerice durante 30 minutos.
Una vez polimerizado el gel, retire la tira de cinta de la parte inferior del cassette y vuelva a colocar el cassette en el conjunto del tanque PAGE. Llene las cámaras superior e inferior con las respectivas soluciones tampón. Disolver muestras secas de glicosaminoglicanos en el volumen mínimo necesario de agua filtrada desionizada y mezclar con el tampón de carga de muestras en una proporción de uno a uno.
Cargue las muestras y las escaleras de oligosacáridos HS en el gel. Ejecute el gel durante cinco minutos a 100 voltios, luego hágalo funcionar a 200 voltios durante 20 a 100 minutos, dependiendo del porcentaje de acrilamida de la solución de gel de resolución. Una vez que se complete la ejecución, desmonte el cassette y extraiga cuidadosamente el gel en un recipiente grande y limpio lleno de agua filtrada desionizada.
Luego deseche el agua y manche el gel en una solución de tinción azul alciano durante cinco minutos. Deseche la mancha azul alciano y lave rápidamente dos o tres veces con agua filtrada desionizada hasta que se haya eliminado la mayor parte de la solución de tinción azul alciano. Manche el gel en una solución de tinción de nitrato de plata en un recipiente fresco y limpio durante 30 minutos.
Luego lave de dos a tres veces durante 30 minutos cada una en agua filtrada desionizada para eliminar completamente la solución de tinción de plata. Deseche el agua y agregue la solución de desarrollo. Observe cuidadosamente el gel para la aparición de bandas.
Dependiendo de la calidad de la mancha y la masa de la muestra cargada, el desarrollo puede tardar desde unos pocos segundos hasta varios minutos. Tan pronto como las bandas deseadas sean visibles, deseche inmediatamente la solución en desarrollo y lave el gel brevemente con la solución STOP. Los glicosaminoglicanos aislados y purificados se visualizaron mediante la técnica de tinción de azul y plata de Alcian después de la resolución dependiente de la densidad mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida.
Como se ve en esta figura, los oligosacáridos de sulfato de heparán de diferentes longitudes de polímero fueron fácilmente detectables utilizando este enfoque basado en PAGE. El límite de detección de este método, tan bajo como 0,5 microgramos, muestra que la técnica es altamente sensible en la detección de glicosaminoglicanos aislados y purificados a partir de muestras biológicas. De los cuatro oligosacáridos diferentes de sulfato de heparina visualizados utilizando este método, la heparina no fraccionada fue la menos fácilmente detectable.
Debido a la polidispersidad de la heparina no fraccionada, la densidad de cada banda individual de esta muestra es menor que las bandas producidas por una masa igual de oligosacáridos de heparina purificada. La eficiencia de la purificación de glicosaminoglicanos a partir de muestras biológicas líquidas se evaluó utilizando muestras de lavado broncoalveolar recolectadas de ratones, que originalmente contenían concentraciones relativamente bajas de glicosaminoglicanos. Además, se demostró el éxito de esta técnica utilizando sulfato de heparina aislado de homogeneizado de pulmón entero, que produjo una amplia cantidad de sulfato de heparina aislado, con los fragmentos más pequeños que equivalen a aproximadamente 10 subunidades disacáridas en masa.
Es muy importante usar reactivos recién preparados y filtrar cada reactivo utilizado en este protocolo. Es fundamental utilizar reactivos de la más alta pureza y calidad para realizar con éxito esta técnica.
