Ce protocole décrit une technique simple qui peut être utilisée pour détecter la présence et mesurer la longueur des glycosaminoglycanes, qui sont des molécules d’importance de plus en plus reconnue pour de nombreux processus biologiques. Cette technique est facilement adaptable à la plupart des laboratoires de sciences de la vie. Des techniques glycomiques comparables nécessitent souvent de l’équipement et de l’expertise que l’on ne trouve que dans les laboratoires de recherche en glycochimie.
Cette technique peut être particulièrement utile aux chercheurs qui s’intéressent à l’étude du glycocalyx, une couche polysaccharidique qui tapisse les surfaces endothéliales et épithéliales du corps humain. Commencez par placer une cassette vide dans le réservoir PAGE. Couler un gel résolvant en mélangeant 10 millilitres de solution de gel résolvant avec 60 microlitres de persulfate d’ammonium fraîchement préparé à 10% dans un tube de 15 millilitres.
Ajoutez ensuite 10 microlitres de TEMED. Inverser doucement le tube deux à trois fois. Ajouter rapidement 10 millilitres de la solution de gel de polyacrylamide activée à la cassette à l’aide d’une pipette.
Superposez avec deux millilitres d’eau filtrée désionisée et laissez le gel résolvant polymériser pendant 30 minutes. Une fois que le gel de résolution a complètement polymérisé, jetez l’eau superposée. Couler le gel empilable en mélangeant trois millilitres de solution de gel empilable avec 90 microlitres de persulfate d’ammonium à 10% fraîchement préparé dans un tube de 15 millilitres.
Ajoutez ensuite trois microlitres de TEMED et inversez doucement le tube deux à trois fois. Utilisez une pipette pour ajouter rapidement la solution de gel empilable sur le gel de résolution solidifié jusqu’à ce que la cassette soit remplie à ras bord. Insérez complètement le peigne inclus avec la cassette de gel de polyacrylamide vide et laissez le gel empilable polymériser pendant 30 minutes.
Une fois le gel polymérisé, retirez la bande de bande du fond de la cassette et replacez la cassette dans le réservoir PAGE. Remplissez les chambres supérieure et inférieure avec les solutions tampons respectives. Dissoudre les échantillons de glycosaminoglycanes séchés dans le volume minimum nécessaire d’eau filtrée désionisée et mélanger avec le tampon de charge de l’échantillon dans un rapport de un pour un.
Chargez les échantillons et les échelles d’oligosaccharides HS dans le gel. Préexécutez le gel pendant cinq minutes à 100 volts, puis faites-le fonctionner à 200 volts pendant 20 à 100 minutes, selon le pourcentage d’acrylamide de la solution de gel résolvant. Une fois la course terminée, démontez la cassette et extrayez soigneusement le gel dans un grand récipient propre rempli d’eau filtrée désionisée.
Ensuite, jetez l’eau et tachez le gel dans une solution de coloration bleu Alcian pendant cinq minutes. Jetez la tache bleue d’Alcian et lavez rapidement deux à trois fois avec de l’eau filtrée désionisée jusqu’à ce que la majeure partie de la solution de coloration bleue d’Alcian ait été éliminée. Tachez le gel dans une solution de coloration au nitrate d’argent dans un récipient frais et propre pendant 30 minutes.
Ensuite, lavez deux à trois fois pendant 30 minutes chacune dans de l’eau filtrée désionisée pour éliminer complètement la solution de coloration à l’argent. Jetez l’eau et ajoutez la solution en développement. Observez attentivement le gel pour l’apparition de bandes.
Selon la qualité de la tache et la masse de l’échantillon chargé, le développement peut prendre de quelques secondes à plusieurs minutes. Dès que les bandes souhaitées sont visibles, jetez immédiatement la solution en développement et lavez brièvement le gel avec la solution STOP. Les glycosaminoglycanes isolés et purifiés ont été visualisés à l’aide de la technique de coloration au bleu Alcian et à l’argent après résolution dépendante de la densité par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
Comme le voit cette figure, les oligosaccharides de sulfate d’héparane de différentes longueurs de polymère étaient facilement détectables à l’aide de cette approche basée sur PAGE. La limite de détection de cette méthode, aussi basse que 0,5 microgramme, montre que la technique est très sensible à la détection de glycosaminoglycanes isolés et purifiés à partir d’échantillons biologiques. Parmi les quatre oligosaccharides d’héparine sulfate différents visualisés à l’aide de cette méthode, l’héparine non fractionnée était la moins facilement détectable.
En raison de la polydispersité de l’héparine non fractionnée, la densité de chaque bande individuelle de cet échantillon est inférieure aux bandes produites par une masse égale d’oligosaccharides d’héparine purifiés. L’efficacité de la purification des glycosaminoglycanes à partir d’échantillons biologiques liquides a été évaluée à l’aide d’échantillons de lavage broncho-alvéolaires prélevés sur des souris, qui contenaient à l’origine des concentrations relativement faibles de glycosaminoglycanes. De plus, le succès de cette technique a été démontré en utilisant du sulfate d’héparine isolé de l’homogénat pulmonaire entier, ce qui a donné une grande quantité de sulfate d’héparine isolé, les plus petits fragments équivalant à environ 10 sous-unités de disaccharide en masse.
Il est très important d’utiliser des réactifs fraîchement préparés et de filtrer tous les réactifs utilisés dans ce protocole. Il est essentiel d’utiliser des réactifs de la plus haute pureté et qualité pour réussir cette technique.
