Questo protocollo descrive una tecnica semplice che può essere utilizzata per rilevare la presenza e misurare la lunghezza dei glicosaminoglicani, che sono molecole di importanza sempre più riconosciuta per molti processi biologici. Questa tecnica è facilmente adattabile alla maggior parte dei laboratori di scienze della vita. Tecniche glicemiche comparabili spesso richiedono attrezzature e competenze che si trovano solo nei laboratori di ricerca glicochimica.
Questa tecnica può essere particolarmente utile per i ricercatori che sono interessati a studiare il glicocalyx, un rivestimento polisaccaridico che riveste le superfici endoteliali ed epiteliali del corpo umano. Iniziare inserendo una cassetta vuota nel serbatoio PAGE. Fondere un gel risolutivo mescolando 10 millilitri di soluzione di gel risolutivo con 60 microlitri di persolfato di ammonio appena preparato al 10% in un tubo da 15 millilitri.
Quindi aggiungere 10 microlitri di TEMED. Capovolgere delicatamente il tubo due o tre volte. Aggiungere rapidamente 10 millilitri della soluzione di gel di poliacrilammide attivata alla cassetta usando una pipetta.
Sovrapporre con due millilitri di acqua filtrata deionizzata e lasciare polimerizzare il gel risolutivo per 30 minuti. Dopo che il gel risolutivo è stato completamente polimerizzato, scartare l'acqua sovrapposta. Fondere il gel impilante mescolando tre millilitri di soluzione di gel impilante con 90 microlitri di persolfato di ammonio al 10% appena preparato in un tubo da 15 millilitri.
Quindi aggiungere tre microlitri di TEMED e invertire delicatamente il tubo due o tre volte. Utilizzare una pipetta per aggiungere rapidamente la soluzione di gel impilabile sul gel risolutivo solidificato fino a quando la cassetta non viene riempita fino all'orlo. Inserire completamente il pettine incluso con la cassetta vuota in gel di poliacrilammide e lasciare polimerizzare il gel impilante per 30 minuti.
Una volta che il gel è polimerizzato, rimuovere la striscia di nastro dal fondo della cassetta e riporre la cassetta nel gruppo serbatoio PAGE. Riempire le camere superiore e inferiore con le rispettive soluzioni tampone. Sciogliere i campioni di glicosaminoglicano essiccati nel volume minimo necessario di acqua filtrata deionizzata e mescolare con il tampone di carico del campione in un rapporto uno a uno.
Caricare i campioni e le scale oligosaccaridici HS nel gel. Prerun il gel per cinque minuti a 100 volt, quindi eseguirlo a 200 volt per 20-100 minuti, a seconda della percentuale di acrilammide della soluzione di gel risolutivo. Una volta completata la corsa, smontare la cassetta ed estrarre accuratamente il gel in un grande contenitore pulito pieno di acqua filtrata deionizzata.
Quindi scartare l'acqua e macchiare il gel in soluzione colorante blu Alcian per cinque minuti. Scartare la macchia blu di Alcian e lavare rapidamente due o tre volte con acqua filtrata deionizzata fino a quando la maggior parte della soluzione di colorazione blu Alcian non è stata rimossa. Macchiare il gel in una soluzione colorante di nitrato d'argento in un contenitore fresco e pulito per 30 minuti.
Quindi lavare due o tre volte per 30 minuti ciascuna in acqua filtrata deionizzata per rimuovere completamente la soluzione colorante all'argento. Scartare l'acqua e aggiungere la soluzione in via di sviluppo. Osservare attentamente il gel per la comparsa di bande.
A seconda della qualità della macchia e della massa del campione caricato, lo sviluppo può richiedere da pochi secondi a diversi minuti. Non appena le fasce desiderate sono visibili, scartare immediatamente la soluzione in via di sviluppo e lavare brevemente il gel con la soluzione STOP. I glicosaminoglicani isolati e purificati sono stati visualizzati utilizzando la tecnica di colorazione blu e argento di Alcian dopo la risoluzione dipendente dalla densità mediante un'elettroforesi su gel di poliacrilammide.
Come si vede in questa figura, gli oligosaccaridi di eparina solfato di diverse lunghezze polimeriche erano facilmente rilevabili utilizzando questo approccio basato su PAGE. Il limite di rilevazione di questo metodo, a partire da 0,5 microgrammi, mostra che la tecnica è altamente sensibile nel rilevare glicosaminoglicani isolati e purificati da campioni biologici. Dei quattro diversi oligosaccaridi di eparina solfato visualizzati utilizzando questo metodo, l'eparina non sezionata era meno facilmente rilevabile.
A causa della polidispersità dell'eparina non frazionata, la densità di ogni singola banda di questo campione è inferiore alle bande prodotte da una massa uguale di oligosaccaridi di eparina purificati. L'efficienza della purificazione del glicosaminoglicano da campioni biologici liquidi è stata valutata utilizzando campioni di lavaggio broncoalveolare raccolti dai topi, che originariamente contenevano concentrazioni relativamente basse di glicosaminoglicani. Inoltre, il successo di questa tecnica è stato dimostrato utilizzando eparina solfato isolata da intero polmone omogeneizzato, che ha prodotto un'ampia quantità di eparina solfato isolata, con i frammenti più piccoli pari a circa 10 subunità disaccaride in massa.
È molto importante utilizzare reagenti appena preparati e filtrare ogni reagente utilizzato in questo protocollo. È fondamentale utilizzare reagenti della massima purezza e qualità per eseguire con successo questa tecnica.
