Este protocolo puede mejorar significativamente la expansión de células NK funcionales, no exhaustivas y similares a la memoria ex vivo en comparación con otras células alimentadoras basadas en el sistema de expansión. Este es un método más simple en comparación con otros protocolos que utilizan celdas de alimentación en las que omitimos el paso de aislamiento de células NK antes de la expansión de células NK. Este protocolo puede proporcionar un número suficiente de células NK y CAR-NK para inmunoterapia.
Esta técnica es altamente reproducible. Sin embargo, el uso de materiales de partida nuevos y frescos y tener cuidado de no perturbar las células NK durante los primeros días de expansión es crucial. Comience por identificar y seccionar las áreas de tejido viables utilizando equipos quirúrgicos estériles para obtener linfocitos.
Luego, coloque los tejidos seccionados en 30 mililitros de HBSS sin calcio ni magnesio y mantenga el tejido en hielo hasta que esté listo para el aislamiento. Trabajando dentro de un gabinete de bioseguridad, corte el tejido en cubos de menos de 0,5 centímetros con cuchillas de afeitar y pinzas estériles. Coloque las piezas de tejido picado, no más de 4 gramos, en los tubos disociadores de tejido y agregue 10 mililitros de colagenasa IV a las piezas de tejido.
Para picar el tejido a fondo, trate los tubos disociadores de tejido en un disociador de tejido a 37 grados centígrados. Después de retirar los tubos del disociador de tejido, triture el tejido picado a través de un colador de células de nylon de 40 micras utilizando el extremo posterior de una jeringa de 5 mililitros. Deseche los fragmentos grandes no digeridos.
Gire el eluyente recolectado a 400 g durante 5 minutos a temperatura ambiente y aspire el sobrenadante antes de resuspender los gránulos celulares en sílice recubierta con polivinilpirrolidona al 30% para eliminar las células grasas. Gire las células como se describe antes de resuspender el pellet celular en 9 mililitros de medios R-10. Para separar los linfocitos de los glóbulos rojos y las células polimorfonucleares, coloque cuidadosamente la suspensión celular sobre 4 mililitros de Ficoll o medios de separación de linfocitos.
Separar las capas centrifugando a 400G durante 23 minutos a temperatura ambiente con la aceleración y los frenos apagados. Luego, decantar cuidadosamente la capa media-superior y cosechar la interfase que contiene linfocitos infiltrantes de tejido. Enjuague las células con 10 mililitros de medios y proceda al análisis o al protocolo de expansión de células asesinas naturales primarias, o NK.
Lave las células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, y 100 células 221-mIL-21 irradiadas gamma por separado mediante centrifugación a 400G durante 5 minutos con 10 mililitros de medios R-10. Después de la centrifugación, guardar 1 x 10 en las 6ª PBMC para citometría de flujo y mezclar 5 x 10 a las 6ª PBMC con 10 x 10 a la 6ª 100 células 221-mIL-21 irradiadas gamma en una placa especial de 6 pocillos. Agregue 30 mililitros de medios R-10 suplementados con interleucina-2 humana e interleucina-15 humana a la misma placa de 6 pocillos e incube la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono, reemplazando el medio cada 3 a 4 días.
Durante la incubación, registre la viabilidad total del número de células asesinas naturales de sangre periférica, o PBNK, y realice citometría de flujo cada 3 a 4 días para calcular la tasa de expansión de células NK. Agregue 1.8 x 10 a las 6ª células 293T en 11 mililitros del medio D-10 por placa de 100 milímetros tratada e incube células 293T a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. En un tubo de 1,70 mililitros, mezcle 470 microlitros del medio sérico reducido con 30 microlitros del reactivo de transfección.
En un tubo separado de 1,70 mililitros, agregue 2,5 microgramos de plásmido pRDF, 3,75 microgramos de plásmido Pegpam3 y 2,5 microgramos de construcción CAR en vector SFG en el medio sérico reducido para hacer el volumen final de 500 microlitros. Mezcle el contenido del tubo con el tubo de 1,70 mililitros preparado anteriormente de manera gota a gota. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, agregue 1 mililitro de la mezcla del tubo a la placa celular 293T de manera gota a gota y coloque la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas.
Diluir la proteína retronectina con PBS a una concentración final de 50 a 100 microgramos por mililitro. Agregue 500 microlitros de retronectina diluida en cada pocillo de una placa de 24 pocillos sin tratar. Luego, selle la placa con parafilm e incube la placa a 4 grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, centrifugar la placa de retronectina a 2, 103G durante 30 minutos a 4 grados centígrados y desechar el sobrenadante. Después de bloquear cada pocillo de la placa de 24 pocillos con 1 mililitro de medio R-10, incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 1 hora. Filtre las células 293T previamente transfectadas utilizando un filtro de 0,45 micras para recoger el sobrenadante del retrovirus.
Alícuota 2 mililitros del sobrenadante de retrovirus filtrado en cada pocillo de la placa de retronectina de 24 pocillos. Centrifugar la placa de retronectina de 24 pocillos a 2, 103G durante 2 horas en una centrífuga precalentada a 32 grados centígrados. Mientras se centrifugan las placas, recoja las células PBNK expandidas del Día 0 y cuente las células con Trypan Blue.
Diluir las células PBNK expandidas con medios R-10 suplementados con interleucina-2 e interleucina-15 a la concentración de 2.5 x 10 a la 5ª a 5ª células por mililitro. Después de la centrifugación de la placa de retronectina de 24 pocillos, aspirar parcialmente el sobrenadante de retrovirus de cada pocillo. Luego, agregue 2 mililitros de las células PBNK expandidas diluidas a cada pocillo.
Centrifugar la placa a 600 G durante 10 minutos a 32 grados centígrados antes de incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas. Transfiera las células de la placa de 24 pocillos a un tubo de centrífuga de 50 mililitros para centrifugar el tubo a 400 G durante 5 minutos. Después de resuspender el pellet con 1 mililitro de medio R-10, transfiera las células resuspendidas a una placa especial de 6 pocillos que contenga 30 mililitros de medios R-10 suplementados con interleucina-2 e interleucina-15.
Incube la placa especial de 6 pocillos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con medios refrescantes y calcule la tasa de expansión de la célula NK cada 3 a 4 días. Se demostró que las células PBNK expandidas por 221-mIL-21 se expanden casi 5 x 10 hasta los 4º pliegues. Y la pureza de la célula NK se mantuvo en alrededor del 85% durante la expansión de 21 días.
Antes de la expansión, se examinó la robustez del sistema de expansión 221-mIL-21 mediante la tinción de PBMC para anti-CD56 y anti-CD3, que mostraron una pureza celular del 7,09% para las células NK y un alto porcentaje de células T. En el día 4 de PBMC y cocultivo 221-mIL-21, se verificó la pureza de NK antes de la transducción de CAR-NK. Las células CAR-NK teñidas para anti-CD56, anti-CD3 y anti-IgG humana mostraron una alta población de células NK el día 7 y se observó una alta eficiencia de transducción de CAR de aproximadamente el 70%.
El día 18, la expresión de CAR en varios subconjuntos se verificó con citometría de flujo. Después de la expansión de las células NK, las células se pueden utilizar para ensayos funcionales in vitro o para experimentos in vivo. El investigador puede usar este protocolo para expandir NK y CAR-NK para pacientes con deficiencia funcional de NK, así como para otras especies, como el perro.
