Los autores desean agradecer a Priyanka Subrahmanyam útil para los debates. Los autores no tienen ningún interés financiero compitiendo. Este trabajo fue apoyado por becas de la Sociedad Americana del Cáncer, NIH / NCI K01 CA131487, CA162273 R21, R21 CA162277 y P30 inmunología tumoral y el Programa de Inmunoterapia en TJ Webb. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Instituto Nacional del Cáncer o los Institutos Nacionales de Salud.

1. Generación de AAPC <ol><li> Antes de añadir proteínas a los granos, preparar todos los reactivos y tampones: tampón borato 0,1 M, 1x D-PBS (sin Ca 2 + y Mg 2 +); Buffer bolas de lavado (1X PBS 5% de suero humano AB + azida sódica al 0,02%) ; medio completo (medio RPMI 100 mM de piruvato de sodio, 10 mM no esencial solución de vitaminas, 100 mM de solución de vitamina MEM, 1% de 2-mercaptoetanol, 10 mM ciprofloxacina, 5% de suero humano AB); tampón de MACS (1 L PBS libre de Ca 2 + y Mg 2 +, 5 g de BSA, y 2 mmol EDTA). </li><li> Enjuague 1 ml Dynabeads M-450 perlas de epoxi con 3 ml de tampón estéril 0,1 M de borato (ácido bórico y agua, pH 7,0 a 7,4) en un vial de 5 ml de vidrio claro de borosilicato roscado. </li><li> En otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 100 g hCD1d Ig-dímero y 20 moléculas coestimuladoras microgramos (ejemplo: anti-CD28mAb) a 1 ml de PBS w / o Ca 2 + o Mg 2 +. </li> &lt;li&gt; Colocar cordón vial de vidrio que contiene el imán y el tampón borato aspirado de cuentas. Agregue la mezcla de proteína de 1,2 a paso vial de vidrio y coloque la tapa. Mezclar inmediatamente por inversión del vial, cubra la tapa con parafilm, y el lugar en un mezclador y se incuban durante la noche a 4 ° C. </li><li> El día siguiente, vial de vidrio en lugar del imán y eliminar mezcla de proteínas, evitando cuidadosamente perlas. Lavar las perlas mediante la adición de 3 ml de bolas de tampón de lavado (PBS con 5% de suero AB 0,02% de azida sódica), e incubando a 4 ° C en un agitador rotatorio durante 5 min. Repita dos veces. </li><li> Perlas se pueden almacenar en esta mezcla de lavado de perlas. Para hacer AAPC funcional, quitar una pequeña parte alícuota y contar las perlas usando un hemocitómetro. Comprobar que las proteínas se cargan de forma estable sobre las perlas por tinción con anticuerpos (por ejemplo, PE-conjugado anti-IgG1 de ratón) y la realización de análisis de citometría de flujo. </li><li> Para cargar perlas con antígeno, quitar 5 x 10 7 perlas, y agregar a un pequeño vial de vidrio de 1,5 ml, enjuague perlas con 1 ml de PBS estéril. Resuspend lavado bolas con 1 ml de PBS estéril y añadir antígeno; ejemplo: Carga con α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Nota: Si bien, no hemos detectado ningún problema con solubilidad en lípidos o la formación de micelas, los lípidos deben ser manejados de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Específicamente, KRN7000 se reconstituyó en DMSO (1mg/ml) para estos estudios. KRN7000 y otros antígenos glicolípidos también se puede disolver en 0,2 mg / ml de PBS que contenía 0,5% de Tween-20 (sonicar 2 hr. A 37 ° C). IMPORTANTE-La AAPC necesitan ser cargados durante al menos 48-72 horas antes de su uso. </li></ol> 2. Aislamiento de CD161 + CD3 + células <ol><li> Recoger las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Para la separación de densidad de Ficoll centrifugación en gradiente de linfocitos procedentes de un paquete de la capa leucocitaria o leucoféresis, primero diluir sangre heparinizada con un volumen igual de 1X PBS a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 15 ml de Ficoll (calentó a temperatura ambiente) a tubos de 50 ml cónicos. Poco a poco superposición25 ml de la mezcla de sangre diluida en la parte superior de la Ficoll. Centrifugar a 2.000 rpm durante 30 min a temperatura ambiente con el freno quitado. </li><li> Retire con cuidado la interfaz de linfocitos (anillo blanco entre los medios de comunicación y Ficoll) con una pipeta Pasteur y transferirlos a un nuevo tubo de 50 ml cónico. </li><li> Lavar las células llenando el tubo de 50 ml con PBS y centrifugar a 1.500 rpm durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y se combinan los tubos de un solo individuo a un solo tubo y lavar las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de nuevo con 20 ml de PBS. Luego, cuente las CMSP y volver a suspender a una concentración de 5 x 10 7 células / ml en tampón de MACS (1 l de PBS libre de Ca 2 + y Mg 2 +, 5 mmol g de BSA, y EDTA 2). </li><li> Con el fin de aislar la fracción de células T, comenzar con 2 ml de PBMC (10 8 células) y añadir 100 ml de solución Pan enriquecimiento de células T del Kit de EasySep humano Enriquecimiento T Cell. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min. </li&gt; <li> Añadir 100 l de partículas magnéticas a la solución y se incuba a temperatura ambiente durante otros 10 min. Llevar el volumen final de disolvente de 2,5 ml y colocar el tubo en el imán púrpura por 5 min. Rápidamente verter el CD3 + fracción en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Lavar las células mediante la adición de 5 ml de tampón de MACS frío, contar el número de células viables, y una alícuota para la tinción de FACS. </li><li> Para seleccionar las células CD161 +, primero se resuspenden las células T enriquecidas en 980 l de hielo frío tampón de MACS, añadir 10 g mAb anti-CD161, e incubar en la nevera durante 10 min. </li><li> Centrifugar las células a 1.500 rpm a 4 ° C durante 5 min. Entonces reconstituir el sedimento celular en 800 l de tampón de MACS. Añadir 200 l de anti-IgG1 de ratón y microperlas de incubar la solución durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Durante esta etapa de incubación, equilibrar una columna LS mediante la adición de 3 ml de tampón MACS. </li><li> A continuación, se lavan las células por centrifugación de 1.500 rpm a 4 ° C durante 5 min. Resupasar las células en 3 ml de tampón MACS. Entonces pipetear las células en la columna LS MACS separación. Asegúrese de evitar la generación de burbujas pipeteando lentamente. Lavar la columna mediante la adición de 3 ml de tampón de MACS. Repita dos veces. </li><li> Añadir 3 ml de tampón MACS fresco y eliminar la columna de imán. Colocar la columna en un tubo cónico de 15 ml. Inserte el émbolo y empujar contenido para obtener purificados CD161 + CD3 + células. Recuento de células NKT enriquecido fracción. Usted debe tener 2-4 millones de células. </li></ol> 3. AAPC mediada por la expansión de células NKT <ol><li> Configurar el co-cultivo mediante la adición de 10 6 enriquecidos CD161 + CD3 + células T y 10 AAPC 6 en 16 ml de medio completo (medio completo + IL-2, 100 U / ml). Placa de esta mezcla por adición de 160 l / pocillo volumen final de 96 pocillos a un cultivo de tejidos de poliestireno tratada, placa de fondo en U con tapa baja evaporación. Realizar cambio de medio cada día 7 th mediante la adición de 80 l de medio fresco. </li><li> Cosechacélulas, contar y realizar la tinción FACS en el día 12-14. </li><li> Los expandidas células NKT se puede replated como se describe anteriormente en el paso 3,1, específicamente resuspender 10 6 células T expandidas y 10 AAPC 6 en 16 ml de medio completo. Placa de esta mezcla mediante la adición de 160 l / pocillo a una U de 96 pocillos de la placa inferior. Continuar para actualizar medio de cocultivo cada día 7 th mediante la adición de 80 l de medio fresco. </li><li> Lo mejor es congelar las células NKT adicionales después de la segunda ronda de expansión (1 x10 6 / criovial en 1 ml-5% de DMSO / 95% de FBS.) </li></ol> 4. Prueba funcional: AAPC mediada por la estimulación de las células NKT <ol><li> Configurar 5x10 4 células NKT / pocillo con 5x10 5 AAPC en 200 l de volumen final (medio completo) en U de 96 pocillos de la placa inferior. </li><li> Harvest sobrenadante de cultivo celular para ELISA después de 24-48 horas. </li></ol>

<ol>
	<li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+population+of+T-cell+receptor+&#945;&#946;-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V&#946;+gene+family.">A novel population of T-cell receptor &#945;&#946;-bearing thymocytes which predominantly expresses a single V&#946; gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li><li>Prigozy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolipid+antigen+presentation+by+CD1d+molecules.">Glycolipid antigen presentation by CD1d molecules.</a> Science. 291, 664-667 (2001).</li><li>Davodeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+phenotypic+and+functional+similarities+between+human+and+murine+&#945;&#946;+T+cells+expressing+invariant+TCR+&#945;-chains.">Close phenotypic and functional similarities between human and murine &#945;&#946; T cells expressing invariant TCR &#945;-chains.</a> J. Immunol. 158, 5603-5611 (1997).</li><li>Exley, M., Garcia, J., Balk, S. 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Immunol. 39, 1046-1055 (2009).</li><li>Ugel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+administration+of+artificial+antigen-presenting+cells+activates+low-avidity+T+cells+for+treatment+of+cancer.">In vivo administration of artificial antigen-presenting cells activates low-avidity T cells for treatment of cancer.</a> Cancer Res. 69, 9376-9384 (2009).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

AAPC puede ser usado para estudiar los requisitos básicos para la activación de las células NKT y que tiene un valor clínico potencial para la expansión ex vivo de células T NK para la inmunoterapia adoptiva. Mescher et al. Describe uno de los primeros sistemas basados ​​en el talón, donde la clase I del MHC murino biotinilado-péptido-constructos individuales de la cadena se combinaron con moléculas coestimuladoras biotinilados B7.1 y B7.2 través de la estreptavidina a la superficie de microesferas de látex 14, 15. Este enfoque ha sido utilizado con éxito para estimular antígenos específicos de células T de ratones transgénicos. Además, dado que este método utiliza una sola cadena de MHC-péptido para asegurar una carga homogénea de las moléculas del MHC, cada antígeno de péptido diana requeriría una nueva transfección para la expresión de la deseada cadena única MHC-péptido, por lo tanto limitar la generalidad de la enfoque. Es importante destacar que el grupo del Dr. Schneck fue pionero en la cuenta de base AAPC, desarrollando otro no celular AAPC basada en grano, Mediante acoplamiento HLA-Ig, la señal 1, y anti-CD28, señal 2, sobre perlas magnéticas. HLA-Ig, una forma única multimérico de HLA fusionado a una inmunoglobulina molecular andamio 16, 17 fue desarrollado por su grupo. Posteriormente, se desarrollaron MHC-Ig basado AAPC, que se ha demostrado que ampliar eficazmente CMV y MART-1 CTL específicos 18. Aquí, hemos demostrado que CD1d-Ig AAPC base puede utilizarse para expandir las células NKT funcionales. Un estudio ha utilizado un sistema similar para examinar la interacción física de las células NK con CD1d 19. En particular, hemos diseñado una célula artificial que presenta antígeno que es adaptable a cualquier requerimiento que considere necesarios para la proliferación de células NKT óptima. El método de expansión de AAPC ofrece un método sencillo y fiable para la expansión y enriquecimiento de las células NKT humanos. Nuestra AAPC puede ser modificado para evaluar sistemáticamente el papel de un grupo de moléculas coestimuladoras potenciales y evaluar su papel en la proliferación de células NKTción y función. Así, AAPC representan una tecnología versátil robusta útiles para inducir y expandir las células NKT. La generación de aAPCs tarda menos de una semana y es adecuado para la producción de grandes cantidades de perlas. Sin embargo, un paso crítico en la generación de la AAPC es confirmar que CD1d-Ig se forma estable inmovilizado sobre la superficie de las perlas y para evaluar su funcionalidad para asegurar la consistencia de lote a lote. Una limitación potencial del sistema es que no hay un mecanismo para desactivar la estimulación, distinta de la separación mecánica de las perlas. Específicamente, el compromiso del receptor de células T (TCR) con el complejo antígeno: CD1d/MHC típicamente generar la sinapsis inmunológica en concierto con moléculas accesorias / de adhesión, lo que puede resultar en la inducción de factores de inhibición o supresión tanto de la célula T y célula presentadora de antígeno. En el sistema de AAPC, estos factores pueden ser regulado positivamente por la célula T, pero el talón no se expresan los ligandos afinespara estos receptores. Además, las células CD4 + células NKT se ha demostrado que suprimen las respuestas antitumorales en ratones y seres humanos, por lo que es posible que la activación no selectiva de todas las células NKT (es decir, la estimulación global con α-GalCer) o la activación del subconjunto incorrecto podría resultar en inmunológica no deseada resultados. Por consiguiente, uno debe fenotípica y funcionalmente caracterizar la población de AAPC-expandida de células NKT. Como se muestra en la Figura 4, se ha encontrado que la estimulación con α-GalCer-cargado AAPC expresar anti-CD28 puede dar lugar a células NKT productoras de Th1, Th2, Th17 y citoquinas de tipo. Murino estudios han informado de que desafío con IL-33, una citoquina recientemente identificada, como resultado mayores niveles circulantes de citoquinas inflamatorias tales como IL-5 e IL-13-. El tratamiento de células NKT con IL-33 aumentaron su producción de citocinas 20. IL-33 es un ligando específico para ST2 y se ha demostrado que ca ST2 solublen bloque IL-33 de señalización. Así, como un ejemplo de una aplicación en el futuro, ST2 AAPC expresar podría ser generado y utilizado para determinar si uno podría inhibir selectivamente la producción de citocinas Th2 mientras que la inducción de la secreción de citocinas Th1 por las células NKT. También se ha informado de que la inyección iv de Kb-expresión de AAPC en C57BL / 6 ratones resultó en la metástasis pulmonar disminuida de tumor 21. Es importante destacar que estos datos demuestran que el tráfico de AAPC en el pulmón y son capaces de activar los subconjuntos de células T efectoras. Por lo tanto, se podría generar múltiples tipos de AAPC y examinar la interacción entre antígenos específicos subconjuntos de células T. En resumen, estos estudios demuestran que CD1d-Ig AAPC base se puede utilizar para reemplazar APC celular normal, y que el potencial de mejorar los actuales enfoques clínicos para la célula NKT-adoptiva basada en la inmunoterapia.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep de células T humano Enriquecimiento Kit </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Aloficocianina CD161 humano mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Imán </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón IgG1 microperlas </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> Dimer XI soluble recombinante dimérica Ratón CD1d: Proteína IG Fusion </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 mAb </td><td> BioLegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 Epoxy perlas </td><td> Life Technologies </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alfa-galactosilceramida (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 Medium </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> No esenciales de aminoácidos </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Vitamina Solution </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La ciprofloxacina </td><td> Alexis Bioquímicos </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> BioLegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (clon C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (Clon C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> BioLegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti-ratón IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC anti-ratón IgG2a </td><td> BioLegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, sin calcio, magnesio no </td><td> Life Technologies </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio azida </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> Suero humano AB </td><td> Atlanta Biológicos </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Rotator Tube Labquake </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon de poliestireno de 5 ml de fondo redondo tubos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 a 959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Wheaton Glass viales de muestra con tapa </td><td> Fisher Scientific </td><td> Small (03-343-6A) Grande (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

T asesinas naturales (NKT) las células son un subconjunto único de células T que muestran marcadores característicos de tanto natural killer (NK) y células T 1. A diferencia de las células T clásicas, las células NKT reconocer antígeno lipídico en el contexto de las moléculas CD1 2. Las células NKT expresan un reordenamiento de la cadena invariante TCRα: Vα14Jα18 en ratones y en seres humanos Vα24Jα18, que se asocia con cadenas de Vβ limitada diversidad 3-6, y se conocen como canónicas o invariante NKT (i NKT) células. Similar a las células T convencionales, las células NKT se desarrollan a partir CD4-CD8-tímicos células precursoras T después de la señalización apropiada por CD1d 7. El potencial para utilizar las células NKT con fines terapéuticos ha aumentado significativamente con la capacidad de estimular y expandir las células NKT humanos con α-galactosilceramida (α-GalCer) y una variedad de citoquinas 8. Es importante destacar que estas células conservan su phenotyp originalese, citocinas secretadas, y la función muestra citotóxica contra líneas de células tumorales. Así, expandidas ex vivo células NKT permanecer funcionales y se puede utilizar para la inmunoterapia adoptiva. Sin embargo, basado en célula NKT-inmunoterapia ha sido limitado por el uso de células autólogas presentadoras de antígeno y la cantidad y calidad de estas células estimuladoras puede variar sustancialmente. DC derivadas de monocitos de pacientes con cáncer se ha informado que expresan niveles reducidos de moléculas coestimuladoras y producen citoquinas inflamatorias menos 9,10. De hecho, en lugar de DC murino APC autólogas se han utilizado para probar la función de las células NKT de pacientes con LMC 11. Sin embargo, este sistema sólo puede ser utilizado para los ensayos in vitro ya que las células NKT no puede ser expandido en DC murina y entonces se utiliza para la inmunoterapia adoptiva. Por lo tanto, un sistema normalizado que se basa en células de antígeno artificiales Presentación (AAPC), podría producir los efectos estimulantes de DC sin los inconvenientes de alo o xenogénica cells 12, 13. En este documento, se describe un método para generar CD1d basado AAPC. Dado que el compromiso del receptor de células T (TCR) por los complejos antígeno-CD1d es un requisito fundamental de la activación de las células NKT, antígeno: CD1d-Ig complejos proporcionan un método fiable para aislar, activar y expandir las poblaciones de células efectoras NKT.

Aquí se describe un método para generar CD1d-Ig basado AAPC, mediante acoplamiento covalente de CD1d-Ig y mAb anti-CD28 a perlas magnéticas para estimular las células NKT como un método estandarizado para la propagación de las células NKT (Figura 1). Primero, uno debe demostrar que las proteínas de fusión de Ig-CD1d son establemente inmovilizado sobre la superficie de las perlas magnéticas. Como se muestra en la Figura 2A, CD1d Ig-y anti-CD28 anticuerpos fueron ambas expresadas en la superficie de las perlas magnéticas. Para examinar la capacidad estimulante de la AAPC, nosotros los co-cultivos de hibridomas de células NKT con AAPC sobrenadantes cosechados durante la noche, la cultura y mide la IL-2 por ELISA. Se encontró que el CD1d-Ig basado AAPC fueron capaces de estimular los hibridomas de células NKT en niveles iguales o superiores a sus homólogos celulares (Figura 3, no se muestran datos). Curiosamente, hemos encontrado que nuestros ratón hibridomas de células NKT se estimulan por CD1d humano basado AAPC (Figura 2B), que proporciona un método simple para probar cada lote de AAPC. Continuación, se trató de demostrar el potencial de propagación de AAPC, las células T tanto humanos fueron aisladas de la sangre periférica. En primer lugar el CD161 + CD3 + fracción de células T fue enriquecido por la separación de esferas magnéticas. Entonces, las células T fueron estimulados cada dos semanas con α-GalCer-cargado AAPC. Es importante destacar, encontramos que incluso con una relativamente baja población inicial de células NKT (0,03%), hemos sido capaces de expandir las células a ~ 67% Vα24 Vβ11 + + (Figura 3). Hemos ampliado las células NKT de la PBMC de muchos voluntarios sanos y pacientes de cáncer y han encontrado que la α-GalCer cargado AAPC fueron capaces de ampliar la población de células NKT en ambos grupos. En particular, el ritmo de expansión fue altamente dependientes del donante. Como se esperaba la mayor de la población inicial de células Vα24 +, mayor es el porcentaje de expansión. Además,cuando se utiliza una población inicial de 2 millones de células CD161 + células T CD3 +, se puede obtener&gt; 10 7 células después de dos rondas de expansión (Tabla 1). Aproximadamente el 80-90% de las ampliadas células NKT son CD4 +, ~ 5% CD8 +, y el resto son presumiblemente CD4-CD8-dobles negativos células NKT. Estos expandidas células NKT se puede utilizar para los estudios funcionales, como se muestra en la Figura 4A-C. Hemos encontrado que nuestro ex vivo ampliado las células NKT de responder a los α-GalCer estimulación y son productores potentes de la IL-17A, TNF α-, y IFN-γ. Cabe señalar que si la población inicial de células T enriquecimiento es bajo y uno es incapaz de realizar la segunda etapa de enriquecimiento CD161, la expansión AAPC mediada por no dar los resultados esperados (véase la Figura 4D, Donante 1). Sin embargo, si el porcentaje de células en circulación NKT es superior a 0,1%, todavía debe ser capaz de obtener una expansión significativai de las células NKT. Colectivamente, estos datos demuestran que CD1d basado AAPC se puede utilizar para ampliar eficazmente y estimular las células NKT humanas primarias. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático de CD1d: Ig basados ​​aAPCs porciones extracelulares de la molécula CD1d se fusionan a la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina proteína separados por un enlazador de aminoácidos corta. Estas moléculas se pueden cargar fácilmente con antígenos lipídicos, tales como α-GalCer, simplemente mediante su incubación con un exceso de los lípidos de interés. AAPC se hicieron mediante el acoplamiento de CD1d-Ig y Abs anti-CD a perlas magnéticas. En este sistema, CD1d-Ig se utiliza para proporcionar el cognado específica de antígeno a través de la señal de TCR y anti-CD28 mAb proporciona la señal coestimuladora. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4.25in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. . Tinción FACS de proteínas de superficie sobre aAPCs A aAPCs) se ensayaron para la presencia de CD1d: IgG dímero (a través de la tinción con PE-conjugado anti-ratón IgG1) así como el anticuerpo anti-CD28 (utilizando conjugado con FITC anti-ratón IgG2a) . histogramas abiertos indican control de isotipo; histogramas rellenos representan los anticuerpos indicados. CD1d-Ig Expresando AAPC puede estimular la producción de IL-2 por las células NKT. B) El Vα14 + NKT de ratón de células de hibridoma, DN32.D3, se co-cultivaron con medio, antígeno soluble (α-GalCer), descargada AAPC o AAPC α-GalCer-cargado. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron y estándar ELISA de tipo sándwich se utilizó para medir la producción de IL-2. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Figura 3. La expansión de las células NKT por CD1d-Ig células recubiertas de antígeno artificiales que presentan. (A) primaria CD3 + CD161 + células doble positivas se aislaron a partir de PBMCs utilizando separación magnética. Las células clasificadas se estimularon con α-GalCer cargado, CD1d-Ig AAPC recubierto durante 14 días. Las células se tiñeron para Vα24 y Vβ11 estimulación AAPC siguiente. (B) células NKT humanas primarias mediada lisis de una línea celular de linfoma B. C1R-CD1d células incubadas con células NKT en las relaciones indicadas en la presencia o ausencia de antígeno, un GalCer-(100 ng / ml) en 96-así placas de fondo en U de 20-24 h. Células NKT lisis celular mediada se evaluó por norma por ensayo de liberación de 51Cr. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Figura 4. Perfiles de citoquinas de AAPC-expandidas células NKT. </strong&gt; Después de la estimulación con α GalCer cargado AAPC durante dos semanas, las células NKT expandidas (1 x 10 5 / así) se co-cultivaron con α-soluble GalCer, PMA / ionomicina, microperlas anti-CD3/28 o α-GalCer AAPC cargado (2 x 10 5 / pocillo) durante 48 hr. (A) IL-17A, (B) de TNF-α, y (C) IFN-γ se midió la producción de citocinas por ELISA estándar. Los datos mostrados son la producción de citoquinas neta después de restar los controles negativos (medios de comunicación y perlas vacías). (D) las células T primarias fueron aisladas a partir de PBMC utilizando la separación de esferas magnéticas. Las células clasificadas se estimularon por dos semanas con la indicación de un-GalCer cargado-AAPC. Las células se tiñeron utilizando Abs específicos para Vα24 + y + Vβ11 y se analizaron por citometría de flujo.

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Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Aquí se describe un método para activar y expandir las células NKT de granel poblaciones de células T usando células artificiales presentadoras de antígenos (AAPC). El uso de CD1d basado AAPC proporciona un método estandarizado para la generación de un número elevado de células NKT funcionales.

Antígeno Artificial célula presentadora (AAPC) La activación mediada y expansión de linfocitos T citolíticos naturales

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

17.9K vistas.  University of Maryland. Aquí se describe un método para activar y expandir las células NKT de granel poblaciones de células T usando células artificiales presentadoras de antígenos (AAPC). El uso de CD1d basado AAPC proporciona un método estandarizado para la generación de un número elevado de células NKT funcionales.

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Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Investigación

Inmunología e Infección

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer Artificial células presentadoras de antígenos (KaAPC) para la utilización eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; El agotamiento de células T humanas específicas de antígeno

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.