Para iniciar sesión en gP2S, escriba su nombre de usuario y contraseña. En el lado izquierdo, puede ver la barra de navegación que consta de un selector de proyecto y un conjunto de elementos de navegación que enumera los tipos de entidad experimentales del flujo de trabajo CryoEMEM, muestras que se componen de proteínas o ligandos o combinación de estos dos, cuadrículas, sesiones de microscopía, sesiones de procesamiento, mapas y modelos. El último elemento de la barra de navegación es un vínculo a la sección de configuración de la aplicación.
Aquí, podrá agregar una serie de entidades que le permitirán registrar experimentos en gP2S. Rellenarlo proporcionará información para varias listas desplegables para usar en todo el sistema. El manuscrito adjunto incluye información detallada sobre cómo instalar y configurar gP2S para que pueda ser utilizado para registrar experimentos.
En estos videos, solo ilustramos uno de los pasos de configuración, cómo registrar un soporte de muestra criogénico, y luego ilustrar con más detalle cómo los usuarios pueden registrar experimentos en gP2S. Los soportes de muestras se pueden configurar una vez que los microscopios se han registrado navegando a la sección del soporte de la muestra. Al registrar un nuevo soporte de muestra, debe especificar con cuál de los microscopios configurados se puede usar y si se puede usar para crioes.
La aplicación gP2S está orientada a proyectos. Significa que la entidad de flujo de trabajo solo se puede crear en el contexto de un proyecto. El proyecto relevante tiene que ser seleccionado de un menú desplegable.
Al seleccionar un proyecto, el número de entidades de cada tipo que están asociadas a este proyecto se muestra en la sección de flujo de trabajo. Puede ver que en este caso en particular, se han registrado 89 muestras, 203 cuadrículas, 80 sesiones de microscopía, cinco sesiones de procesamiento, siete mapas y dos modelos. Al hacer clic en cualquiera de los tipos de entidad de flujo de trabajo, por ejemplo, sesiones de microscopía, se muestra una lista de esas entidades.
Esta lista consta de una etiqueta. También puede haber una bandera, como en este caso, para mostrar si se trataba de una sesión de microscopía de manchas crio o negativas, y hasta seis campos de metadatos clave. En caso de sesión de microscopía, puede ver qué cuadrícula se ha fotoizado, el número de imágenes que se recopilaron, las horas de fecha de inicio y finalización de la sesión, y qué microscopio y detector se utilizaron.
Al seleccionar una de las entidades enumeradas se abre una página de detalles que enumera toda la información disponible para este elemento, que en el caso de las sesiones de microscopía es mucha. Debajo de los detalles de la microscopía, puede ver una lista resumida de todas las entidades antecesoras, como cuadrículas y muestras. Esto permite una navegación muy rápida a través del linaje de la entidad mostrada.
Vayamos a los modelos para visualizar mejor esto. Por último, cualquier entidad en gP2S puede ser comentada seleccionando comentarios. Como puede ver para este modelo en particular, ya existe un comentario.
Al hacer clic en él se muestra quién y cuándo lo creó. Puede agregar otro comentario introduciendo un texto libre y, opcionalmente, adjuntando uno o más archivos. Ahora que hemos recorrido la parte principal de la aplicación, demostraremos cómo registrar entidades experimentales durante un experimento CryoEM.
En el primer paso del flujo de trabajo, se le pedirá que describa el ejemplo. Para ello, primero hay que definir al menos un componente, proteína o ligando. Agregar una nueva proteína requiere solo una etiqueta de proteína, pero para ayudar a describir mejor la proteína, también puede agregar un identificador de purificación.
Este campo puede contener un número de lote o servir como un lugar para una etiqueta de código de barras. Si gP2S se ha personalizado para integrarse con un sistema de registro de proteínas, el PUR ID se puede validar automáticamente y utilizar para recuperar y mostrar información detallada sobre este lote de proteínas. Para los ligandos, una etiqueta y la concentración de stock son obligatorias y otros dos campos son opcionales, el concepto y el identificador de lote de lote.
Una muestra se define por cualquier combinación de proteínas y ligandos y sus concentraciones finales. En nuestro caso, crearemos una muestra que contenga una proteína que haya sido previamente registrada en gP2S. Los componentes son fáciles de encontrar gracias a la lista desplegable de búsqueda.
Si no encuentra el componente, puede crear uno desde cero en este paso. Opcionalmente, también puede especificar otros detalles experimentales de la muestra, como el tiempo y la temperatura de incubación, el búfer y una descripción del protocolo de texto libre. Cuando su muestra esté lista y esté haciendo cuadrículas, navegue a cuadrículas y cree una nueva crio.
Seleccione el tipo de cuadrícula y el protocolo de tratamiento de superficie utilizado, por ejemplo, un protocolo de descarga de resplandor. A continuación, indique si está preparando un cryo o una cuadrícula de manchas negativas y seleccione uno de los protocolos de vitrificación preconfigurados de la lista desplegable. A continuación, seleccione en la lista desplegable la muestra que aplicó a la cuadrícula.
Si decide diluir o concentrar la muestra seleccionada, utilice el botón de alternancia y especifique el factor de dilución o concentración correspondiente. También debe especificar el volumen aplicado a la cuadrícula y, opcionalmente, registrar un tiempo de incubación. Por último, debe definir la ubicación de almacenamiento de la cuadrícula.
Si lo desea, cambie la etiqueta predeterminada y guarde la cuadrícula. Una vez que haya registrado sus cuadrículas, podrá registrar experimentos de recopilación de datos mediante la creación de una sesión de microscopía. El formulario consta de cuatro secciones: información básica, ajustes del microscopio, ajustes de exposición y control del microscopio.
La primera sección contiene información básica, una etiqueta, cambie el valor predeterminado si lo desea. Observe que el sistema rellena automáticamente la fecha y hora de inicio. La fecha y hora de finalización son opcionales porque probablemente registrará la sesión de microscopía mientras su experimento aún está en curso.
Si conoce la fecha y hora de finalización, puede escribirla manualmente o usar el botón ahora para ingresar la actual. A continuación, seleccione qué cuadrícula se fotomente y qué microscopio se utilizó. De forma predeterminada, el microscopio utilizado más recientemente en el proyecto actual está preseleccionado.
Seleccione un detector y, opcionalmente, cuántas imágenes se recopilaron. La tercera sección de la sesión de microscopía contiene información sobre los ajustes de exposición. En esta sección, se registran los siguientes metadatos:aumento, tamaño del punto, diámetro del área iluminada, velocidad de exposición, duración de la exposición y número de fotogramas.
Debe indicar si se utilizaron nanosondas, modo de conteo, fraccionamiento de dosis y súper resolución. Solo se activan si el microscopio y el detector seleccionados tienen estas características. Después de introducir el factor de agrupación de píxeles, si lo hay, se calculan y muestran una serie de parámetros experimentalmente importantes sobre la marcha.
El trabajo de procesamiento de imágenes se registra en una sesión de procesamiento. Cada sesión de procesamiento está relacionada con al menos una sesión de microscopía, que se selecciona en una lista desplegable. Puede agregar más sesiones de microscopía si combina datos de varias sesiones durante el procesamiento.
También debe indicar qué paquetes de software se utilizaron seleccionando la etiqueta del software y su versión. También hay un lugar para algunas notas relacionadas. Usted tiene que proporcionar el número de micrografías y partículas recogidas.
También puede registrar el nombre del directorio o la ruta de acceso completa donde realizó el procesamiento. Una vez que se han obtenido una o más reconstrucciones tridimensionales, los mapas se pueden depositar en gP2S. Cada mapa está asociado a una sesión de procesamiento y consta del archivo de mapa real.
gP2S permite cualquier tipo de archivo. Introduzca metadatos clave como el tamaño del píxel, recomendado es un nivel de contorno para la representación de superficies, qué simetría aplicó, el número de imágenes utilizadas para crear el mapa y la resolución estimada en sus mejores partes, la resolución global promedio y la resolución en las peores partes. Como en el caso, en muchas partes de gP2S, las reglas de validación comprueban si hay errores obvios en la entrada.
Los mapas pueden estar asociados entre sí utilizando diferentes tipos de relaciones. Al registrar una asociación de este tipo, debe seleccionar el tipo de relación y el mapa relacionado. Una vez obtenido un modelo atómico, se puede depositar en gP2S.
Agregue un archivo de modelo, una resolución y el mapa o una lista de mapas de los que se derivó el modelo. Además, es posible indicar que un modelo es una versión refinada de un modelo previamente depositado. Cambie la etiqueta y guarde el registro.
Si colabora con otros investigadores que no tienen acceso a la aplicación, es posible que sea necesario generar documentos de resumen que luego pueda compartir. Para este propósito, gP2S proporciona una funcionalidad de informe. Esto genera un archivo PDF imprimible que incluye todos los metadatos que describen la entidad y cada una de sus entidades antecesoras, incluidos todos los comentarios.
Esta característica es particularmente valiosa después de la deposición del modelo, ya que todos los datos y metadatos que rastrean el linaje del modelo atómico final hasta el final hasta lotes específicos de ligandos de proteínas y moléculas pequeñas a través de sesiones de microscopía y cuadrículas están disponibles en el documento único. Pero se puede generar un PDF desde cualquier página de vista de detalles. Como puede ver, gP2S le permite realizar un seguimiento de varias entidades que están bien estructuradas y son fáciles de navegar.
Como se mostró anteriormente, la validación de datos al registrar entidades concretas contribuye a metadatos de mayor calidad de lo que se podría lograr con hojas de cálculo o blocs de notas clásicos. Gracias por su observación. Esperamos que este video te anime a probar gP2S como el sistema de gestión de información de laboratorio para tu laboratorio CryoEM.
