Cryo-EM se ha convertido en una técnica estándar para la determinación de la estructura de las proteínas y sus complejos. Este protocolo describe las mejores prácticas para obtener conjuntos de datos Cryo-EM de alta resolución a partir de los microscopios TEM de 200 kV de rango medio. Cryo-EM puede determinar la estructura de la proteína en condiciones casi nativas en solución para múltiples estados conformacionales y estados funcionales simultáneamente, lo cual es difícil de alcanzar para otras técnicas estructurales.
La información estructural obtenida se puede utilizar para la elucidación de los mecanismos moleculares de la función de la proteína, así como para el diseño de fármacos basados en la estructura. Por ejemplo, una publicación reciente en la estructura de las fibrillas amiloides reveló múltiples sitios de unión de un ligando vital. Sin embargo, en este protocolo, utilizamos las muestras estándar de apoferritina y proteasoma para demostrar los pasos críticos en la obtención de datos Cryo-EM de alta resolución.
La operación de un Cryo-TEM se ha vuelto más fácil en los últimos años, especialmente debido a la introducción de funciones avanzadas de automatización. Sin embargo, para la primera sesión, le aconsejamos que tenga una capacitación con usuarios más experimentados. A partir de ahí, la progresión en la técnica es relativamente rápida.
La demostración del procedimiento será Adrian Koh, quien es un científico senior de aplicaciones en Thermo Fisher Scientific. Inserte rejillas automáticas en el cassette del cargador automático en condiciones de nitrógeno líquido. Inserte el cassette con rejillas automáticas en una cápsula de transferencia refrigerada por nitrógeno líquido.
Inserte la cápsula en el microscopio y haga clic en el botón Dock en la interfaz de usuario del microscopio para cargar el cassette desde la cápsula en el cargador automático del microscopio. Haga clic en el botón Inventario para verificar la presencia de cuadrículas automáticas en el casete cargado. Luego haga clic en los botones Cargar y Descargar para insertar las cuadrículas automáticas en la columna para imágenes TEM.
Seleccione la pestaña Atlas y haga clic en el botón Nueva sesión para abrir una nueva sesión. Complete detalles como el nombre de la sesión y la ubicación de almacenamiento de datos y haga clic en el botón Aplicar. Seleccione las cuadrículas de interés seleccionando una casilla de verificación junto al número de cuadrícula correspondiente.
Haga clic en el botón Inicio para iniciar una colección totalmente automatizada de atlas de todas las cuadrículas seleccionadas. Cuando se complete la colección, haga clic en las etiquetas de la cuadrícula para revisar los atlas adquiridos. Seleccione la pestaña EPU y vaya a Nueva sesión para crear una nueva sesión en el panel izquierdo.
Seleccione la opción Nueva sesión para utilizar los ajustes preestablecidos ópticos establecidos actualmente. Rellene el nombre de la sesión. Seleccione el tipo manual de la sesión para tener control sobre la selección de taladros individuales y cuadrados de cuadrícula seleccionados para la recopilación de datos más adelante en el protocolo.
Seleccione el modo de adquisición más rápido para utilizar el cambio de imagen sin aberraciones para la recopilación de datos. A continuación, introduzca la ubicación para guardar los metadatos. Haga clic en el botón Aplicar para crear una nueva sesión.
Seleccione la tarea de selección de cuadrados en el panel izquierdo para mostrar el atlas recopilado de la cuadrícula. Identifique los cuadrados de la rejilla con la lámina de soporte intacta sin daños, el hielo vítreo delgado y los orificios de la lámina, la contaminación insignificante del hielo cristalino en el cuadrado de la rejilla y el gradiente de brillo mínimo a través del cuadrado de la rejilla y dentro de los orificios individuales de la lámina. Seleccione los cuadrados de cuadrícula para la recopilación de datos, ya sea en el atlas completo o en imágenes de mosaico de alta calidad.
Haga clic con el botón derecho en un cuadrado de cuadrícula de interés y elija toda la tarea de selección. Haga clic en el botón Auto Eucentric para moverse automáticamente al primer cuadrado de cuadrícula seleccionado. Ajuste la altura eucéntrica y adquiera una imagen cuadrada de cuadrícula para encontrar agujeros de lámina.
Haga clic en el botón Buscar agujeros para encontrar agujeros de lámina en la imagen. Haga clic en el botón Quitar taladros para cerrar el botón de la barra de cuadrícula y anular la selección de taladros cerca de las barras de cuadrícula. Ajuste los límites en el histograma de brillo del filtro de hielo para eliminar todos los agujeros con hielo demasiado grueso y todos los orificios vacíos.
Haga clic con el botón derecho en un agujero en la imagen cuadrada de la cuadrícula y seleccione mover etapa a la ubicación mover etapa aquí. Seleccione la tarea de definición de plantilla en el panel izquierdo. Haga clic en el botón Adquirir para adquirir una imagen completa.
Establezca valores para el retraso después del cambio de imagen a 0,5 segundos y el retraso después del cambio de etapa a cinco segundos. Haga clic en el botón Buscar y centrar taladro para centrar un taladro en la imagen. Seleccione el botón Agregar área de adquisición y haga clic en la imagen para seleccionar la ubicación en el orificio centrado donde se realizará la adquisición de imágenes de alta ampliación.
Seleccione el botón Agregar área de enfoque automático y haga clic en la imagen para seleccionar la ubicación en la lámina de soporte junto al orificio centrado donde se realizará el enfoque automático de la imagen. Haga clic en el área de adquisición verde para establecer una secuencia de valores de desenfoque en la lista de desenfoque en la sección superior de la ventana del software. Después de establecer la configuración específica del enfoque automático, elija la opción Después del centrado para enfocar automáticamente al inicio de cada clúster AFIS.
Elija la opción Lente de objetivo para un enfoque automático más rápido y una deriva de etapa reducida. Haga clic en el botón Preparar todos los cuadrados en la tarea de selección de taladros para establecer automáticamente la recopilación de datos y todos los demás cuadrados de cuadrícula seleccionados de acuerdo con la configuración utilizada en este primer cuadrado de cuadrícula. Seleccione la tarea de definición de plantilla, adquiera una nueva imagen, mueva el escenario a un área limpia en papel de carbón haciendo clic con el botón derecho y seleccione la opción de menú mover etapa aquí.
Seleccione la ficha Funciones automáticas. Después de configurar el desenfoque deseado y la iteración, cambie al ajuste preestablecido de enfoque automático y haga clic en el botón de inicio para ejecutar la función de enfoque automático. Seleccione la tarea Autostigmate, cambie al ajuste preestablecido Thon Ring y presione el botón Inicio.
Seleccione la tarea Autocoma y pulse el botón Inicio. Mueva el escenario a un área con un cuadrado de cuadrícula roto. Confirme la transparencia del área tomando una sola imagen de enfoque automático.
Abra Sherpa UI y seleccione la aplicación Filtro de energía. Haga clic en el botón Centrar y la opción de pérdida cero para centrar la ranura del filtro de energía de pérdida cero. Haga clic en el botón Sintonizar en la opción de isocromaticidad.
Haga clic en la opción Ajustar aumento y ajustar distorsiones en las distorsiones geométricas y cromáticas. Vaya a la pestaña EPU, seleccione la tarea Adquisición automatizada y haga clic en el botón Iniciar ejecución para comenzar la recopilación de datos totalmente automatizada. La figura muestra cuadrículas Cryo-EM que muestran un gradiente de espesor de hielo sobre la superficie de la rejilla.
Las rejillas excluidas de la investigación adicional son la rejilla mala con hielo grueso y una rejilla doblada con hielo malo y contaminación, mientras que las rejillas aceptables son aquellas con buen gradiente de hielo y una rejilla típica con buen hielo delgado y pequeño gradiente de hielo. La figura muestra la representación 3D final del mapa cryo-EM de apoferritina reconstruido. La alta estabilidad y simetría lo convierten en una muestra de referencia óptima para imágenes Cryo-EM de alta resolución y procesamiento de imágenes.
El pulido bayesiano, el refinamiento de CTF y la corrección de la esfera de Ewald dieron como resultado un mapa de resolución de 1.63 angstrom. La figura muestra una vista detallada del mapa cryo-EM de apoferritina reconstruido a nivel de cadena lateral de aminoácidos individuales. La densidad de las cadenas laterales de aminoácidos está bien resuelta y el modelo atómico se puede construir inequívocamente dentro del mapa.
La imagen aquí muestra dos conjuntos de datos diferentes a diferentes valores de desenfoque recopilados de la misma cuadrícula Cryo-EM con cuadrados de cuadrícula similares con una hendidura completamente abierta y una ranura de 10 electronvoltios que indica que la ranura de 10 electronvoltios mejora significativamente el contraste de la imagen. La figura aquí muestra una descripción general del mapa Cryo-EM del proteasoma 20S con subunidades segmentadas utilizadas como muestra estándar de Cryo-EM. Y su vista ampliada con un modelo atómico ajustado representa el núcleo catalítico estable del complejo proteasoma con la simetría D7.
El protocolo contiene dos pasos críticos. Uno, buscando áreas con hielo vítreo delgado que contenga partículas homogéneas. Y dos, configurar la iluminación paralela para la adquisición de datos.
Con las reconstrucciones de alta resolución de proteínas que logran de dos a tres angstroms en resolución, puede comprender mejor los mecanismos moleculares de la enfermedad y mejorar los plomos de los medicamentos. Anteriormente, la cristalización era necesaria si se quería estudiar la base estructural de los fenómenos biológicos. Hoy con Cryo-EM, eso ya no es necesario.
Y así, con Cryo-EM, permitimos a los científicos estudiar una gama más amplia de fenómenos biológicos a nivel estructural.
