La inclinación de la etapa de la muestra proporciona una forma simple y generalizable de aumentar la distribución de orientación de las partículas durante la recopilación de datos crio-EM de una sola partícula. La distribución uniforme de las partículas obtenidas debido a la inclinación de la etapa de la muestra permite mejorar la calidad general del mapa y la interpretabilidad. Comience alineando el microscopio para asegurar la iluminación paralela de la muestra y minimizar las aberraciones del coma.
Para identificar los cuadrados adecuados para la recopilación de datos, registre un atlas de cuadrícula sin inclinación de escenario o con inclinación de escenario, que proporciona una visión general de la calidad general de la cuadrícula y una indicación inicial de las áreas adecuadas para la recopilación de datos. Inspeccione los cuadrados manualmente en el aumento utilizado en el nodo de adquisición cuadrado. Busque los cuadrados donde la lámina está intacta, no se ve deshidratada y tiene un grosor de hielo ideal, y mueva la etapa de la muestra a un cuadrado de interés.
Determine la altura eucéntrica para la posición del escenario usando un oscilante alfa a unos 15 grados de inclinación del escenario y ajuste la altura Z para llevar el escenario a la altura eucéntrica usando el panel del teclado para el microscopio. Asegúrese de que el cambio de imagen sea mínimo durante la rutina de oscilación alfa. Para encontrar una altura Z más precisa, estime en el nodo de enfoque con el aumento utilizado en el nodo de adquisición cuadrado.
Ajuste la configuración del nodo de enfoque y habilite o deshabilite la opción de enfoque Z fino durante la cola inicial de cuadrados. A continuación, pulse Simular. Incline la etapa de la muestra al ángulo de inclinación deseado para la recopilación de datos a la altura eucéntrica real y vuelva a centrar la etapa si es necesario.
Pulse Simular en el nodo de adquisición cuadrado para comenzar a poner en cola destinos para exposiciones completas del nodo de adquisición. A continuación, seleccione un objetivo de enfoque Z y regiones con orificios adecuados para exposiciones de gran aumento y envíe los objetivos a la cola para obtener imágenes. Lleve la etapa de la muestra a su estado no inclinado y luego muévase a la siguiente casilla.
Repita estos pasos hasta que se haya puesto en cola un número adecuado de exposiciones completas. Una vez que todos los cuadrados estén en cola, vaya a todo el nodo de destino y presione Enviar destinos en cola. Seleccione Permitir la verificación por parte del usuario de los objetivos seleccionados en la configuración del nodo e inspeccione manualmente los objetivos seleccionados por el nodo de adquisición de exposición de gran aumento para comprobar si el buscador de orificios EM automatizado puede identificar con precisión las regiones adecuadas para la adquisición de imágenes cuando la etapa de la muestra está inclinada.
Una vez que el usuario esté satisfecho con la precisión de la segmentación, anule la selección de la opción Permitir la verificación del usuario de los objetivos seleccionados para la recopilación automatizada de datos. Aquí se muestran las imágenes representativas de la cuadrícula con aumento cuadrado con diferentes ángulos de inclinación recogidos cerca y lejos de la altura Z eucéntrica. El centro de la viga está indicado por el centro de los anillos concéntricos rojos y la flecha verde indica el cuadrado de interés.
Hay una característica de cuadrícula rota adyacente al cuadrado de interés como referencia. Aquí se muestran las exposiciones representativas de los orificios y los promedios de clase 2D recopilados en ángulos de inclinación de 0 grados, 30 grados y 60 grados. Aunque la concentración de proteína no cambia en los diferentes ángulos de inclinación, un ángulo de inclinación más alto hace que el área fotografiada parezca más concurrida en términos de concentración de partículas.
Los promedios de clase 2D afectados por el hacinamiento se muestran en este cuadro rojo. La simplicidad del protocolo permite a cualquier usuario estándar del microscopio adaptar fácilmente una estrategia de recopilación de datos inclinada.
