El objetivo general de estos procedimientos es cosechar y desagregar las biopelículas de la manera óptima para aumentar la reproducibilidad. En este video se demostrarán tres técnicas, cada una centrada en la cosecha y desagregación de un tipo de superficie diferente. Este video demostrará las técnicas adecuadas para uno, vórtice y sonicación de biopelícula de una superficie dura no porosa, como un cupón de policarbonato del reactor de biopelícula cdc.
Dos, el raspado y homogeneización de la biopelícula de la superficie dura de vidrio de borosilicato no poroso que se encuentra comúnmente en el reactor de flujo de goteo. Y tres, el raspado, el vórtice y la sonicación de la biopelícula de una superficie de tubo de silicona porosa que se encuentra comúnmente en el modelo de catéter. Hola, mi nombre es Kelly Buckingham-Meyer aquí en el Laboratorio de Métodos estandarizados de biopelículas.
En nuestro laboratorio, dividimos los métodos de biopelícula en cuatro componentes: crecimiento, tratamiento, muestreo y análisis. En la literatura revisada por pares, los detalles de cómo se muestrean o cosechan las biopelículas y se desagregan de una superficie suelen ser escasos. Esta es la razón de este video.
Dado que nuestro laboratorio desarrolla y prueba métodos estandarizados de biopelículas, realizamos una extensa revisión de la literatura donde se identificaron los tres métodos más comunes de recolección y desagregación de biopelículas. Esos métodos son el vórtice y la sonicación de la biopelícula a partir de un cupón de policarbonato, el raspado y homogeneización de la biopelícula a partir de un cupón de vidrio de borosilicato, y el raspado, el vórtice y la sonicación de la biopelícula a partir de tubos de silicona. Si bien los métodos escritos en papel son poderosos, esperamos que el video con los detalles técnicos presentados por mi compañera de trabajo Lindsey Miller y yo sea útil.
Para comenzar, cultive la biopelícula madura pseudomonas aeruginosa 15442 de acuerdo con la norma ASTM E2562, el método de prueba estándar para la cuantificación de la biopelícula Pseudomonas aeruginosa cultivada con alto cizallamiento y flujo continuo utilizando el reactor de biopelícula CDC. Al final del período de crecimiento de 48 horas, prepárese para tratar y muestrear cupones de acuerdo con el Estándar ASTM E2871, el Método de Prueba Estándar para Determinar la Eficacia desinfectante contra la Biopelícula Cultivada en el Reactor de Biopelícula de los CDC utilizando el Método de Tubo Único. Luego inserte asépticamente protectores contra salpicaduras en autoclave en tubos cónicos estériles de 50 mililitros utilizando pinzas esterilizadas por llama.
Repita la repetición para todos los tubos que recibirán tratamiento. Los tubos para cupones de control no necesitan un protector contra salpicaduras. Retire asépticamente una varilla del reactor de biopelícula CDC y enjuáguela en 30 mililitros de agua de dilución estéril.
Esto eliminará las células sueltamente adheridas de la biopelícula. Sostenga la varilla paralela a la mesa de trabajo sobre los tubos de muestra con protectores contra salpicaduras. Usando una llave Allen esterilizada por llama, afloje los tornillos del conjunto para dejar caer un cupón recubierto de biopelícula en el tubo.
Repita para el número deseado de cupones. Retire los protectores contra salpicaduras y colóquelos en un recipiente separado para la esterilización. Usando una pipeta serológica de cinco mililitros, pipetee lentamente cuatro mililitros de tratamiento o control en los tubos para que el líquido fluya por el interior de la pared del tubo.
Gire suavemente la parte inferior del tubo para que las burbujas de aire debajo del cupón se desplacen. Permita de 30 a 60 segundos entre cada adición. Al final del tiempo de contacto especificado, pipetee 36 mililitros de neutralizador en los tubos en el mismo orden en que se aplicó el tratamiento o control.
Vórtice cada tubo en el ajuste más alto durante 30 más o menos cinco segundos y asegúrese de que se logre un vórtice completo. Coloque los tubos en el bastidor de tubos suspendidos en el sonicador desgasificado de modo que el nivel de agua en el baño sea igual al nivel de agua en los tubos. Sonicar las muestras a 45 kilohercios, 100% de potencia y función normal durante 30 más o menos cinco segundos.
Repita los ciclos de vórtice y sonicación y termine con un vórtice final, para un total de cinco ciclos. Finalmente, diluya en serie la muestra, coloque la dilución en agar R2A e incube las placas durante 24 horas a 36 grados centígrados. Cuente las colonias según corresponda al método de recubrimiento y registre los datos.
Esta próxima técnica de recolección y desagregación de biopelículas es útil para cupones duros no porosos que son el estándar en el reactor de flujo de goteo. Cultivar una biopelícula madura de Pseudomonas aeruginosa 15442 de acuerdo con la Norma ASTM E2647 el Método de Prueba Estándar para la Cuantificación de Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cultivada Utilizando Reactor de Biopelícula de Flujo de Goteo con Bajo Cizallamiento y Flujo Continuo. Configure la estación de muestreo para incluir una placa de muestreo, etanol al 95% en un vaso de precipitados, un quemador de alcohol, hemostáticos, una herramienta de eliminación de cupones, vasos de precipitados con agua de dilución estéril y tubos de dilución para enjuagar los cupones.
Apague la bomba, retire la tapa del canal y use una herramienta de eliminación de cupones estériles y hemostáticos para quitar el cupón, teniendo cuidado de no molestar la biopelícula. Enjuague el cupón sumergiéndolo suavemente con un movimiento fluido en 45 mililitros de agua de dilución estéril contenida en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Invierta inmediatamente el movimiento para eliminar el cupón.
Coloque el cupón en un vaso de precipitados que contenga 45 mililitros de agua de dilución estéril. Raspe la superficie del cupón cubierta de biopelícula en una dirección descendente durante aproximadamente 15 segundos con una espátula o raspador estéril. Enjuague la espátula o el raspador revolviéndolo en el vaso de precipitados.
Repita el proceso de raspado y enjuague de tres a cuatro veces, lo que garantiza una cobertura completa de la superficie del cupón. Enjuague el cupón manteniéndolo en un ángulo de 60 grados sobre el vaso de precipitados estéril y pipeteando un mililitro de agua de dilución estéril sobre la superficie del cupón. Repetir para un total de cinco enjuagues.
El volumen final en el vaso de precipitados es ahora de 50 mililitros. Trabajando en el gabinete de bioseguridad, homogeneice la muestra de biopelícula raspada. Conecte una sonda homogeneizadora estéril al homogeneizador.
Coloque la punta de la sonda en el líquido y encienda el homogeneizador y aumente hasta 20, 500 RPM. Homogeneizar la muestra durante 30 segundos. Baje las RPM y apague el homogeneizador.
Desinfecte la sonda entre muestras de biopelícula homogeneizando en blanco de dilución estéril de nueve mililitros a 20, 500 RPM durante 30 segundos como se describió anteriormente. Homogeneice un tubo de nueve mililitros de etanol al 70% durante 30 segundos y desconecte la sonda y déjela reposar en el tubo de etanol durante un minuto. Homogeneizar dos espacios en blanco de dilución adicionales.
Además, se puede utilizar una sonda homogeneizadora desechable estéril para cada muestra. Diluya en serie la muestra homogeneizada, coloque las diluciones en R2A utilizando el método de recubrimiento apropiado e incube las placas durante 24 horas a 36 grados centígrados. Cuente las colonias y registre los datos.
Esta técnica final de recolección y desagregación de biopelículas es útil para la biopelícula cultivada en tubos porosos como los tubos de silicona utilizados en el modelo de catéter. Para comenzar este procedimiento, cultive una biopelícula madura de E.coli 53498 en tubos de catéter de silicona. Prepare los materiales de muestreo: tubos enjuagados, un tubo de centrífuga estéril, una placa de Petri estéril vacía, hemostáticos de acero inoxidable esterilizados por llama, tijeras, temporizador y una regla.
Con la bomba en pausa, use etanol al 70% para limpiar el exterior del tubo. Mida dos centímetros desde el extremo, evitando el área unida al conector, y marque el tubo para determinar las ubicaciones de corte. Con tijeras esterilizadas a la llama, corte el tubo en la marca de dos centímetros.
Enjuague el segmento del tubo para eliminar las células planctónicas. Con fórceps esterilizadas por llama, sumerja suavemente el segmento de tubería en 20 mililitros de agua de dilución estéril y luego retire inmediatamente. Coloque el segmento en 10 mililitros de neutralizador.
Con pinzas esterilizadas por llama, sostenga el segmento del tubo y raspe con un palo aplicador de madera estéril hasta que se hayan raspado todas las áreas internas del tubo. Ocasionalmente enjuague el palo en los 10 mililitros de neutralizador y coloque el segmento de nuevo en el tubo de muestra. El segmento de tubos raspados es ahora la dilución de 10 a cero o cero.
Vórtice cada tubo en el ajuste más alto durante 30 más o menos cinco segundos. Coloque los tubos en el bastidor de tubos suspendidos en el baño del sonicador, de modo que el nivel de agua en el baño sea igual al nivel de líquido en los tubos. Sonicate a 45 kilohercios, 100% de potencia y función normal durante 30 más o menos cinco segundos.
Repita este ciclo de vórtice y sonicación, luego termine con el vórtice final. Diluya en serie las muestras en agua tamponada. Envasar en agar de soja tríptico utilizando el método de recubrimiento apropiado y luego incubar los tubos a 36 más o menos dos grados centígrados durante 24 horas.
Cuente las colonias según corresponda al método de recubrimiento utilizado y registre los datos para calcular la media aritmética. Estas cuatro imágenes tomadas por Danielle Or y Blaine Fritz ayudan a ilustrar la importancia de este procedimiento de cosecha y desagregación. Estos cuatro cupones se tiñeron con cristal violeta para ayudar a visualizar la cantidad de biopelícula de Pseudomonas aeruginosa presente en los cupones antes y después del proceso de vórtice y sonicación.
El cupón A está completamente cubierto de biopelícula, mientras que los cupones B, C y D tienen sustancialmente menos biopelícula en su superficie. Los cupones B, C y D fueron sometidos al proceso de vórtice y sonicación descrito anteriormente. Estas dos imágenes tomadas por Lindsey Miller en un microscopio confocal con un aumento de 12.5X muestran una biopelícula de Pseudomonas aeruginosa que fue tratada con la mancha viva / muerta a la luz de fondo.
La imagen de la izquierda se sonicó a 45 kilohercios y 10% de potencia, mientras que la imagen de la derecha se sonicó a 45 kilohercios y 100% de potencia. Claramente, el cupón de la izquierda tiene mucho más biofilm restante en su superficie en comparación con el cupón de la derecha. Esta última figura muestra cómo la manipulación de diferentes parámetros de sonicación afecta a la cantidad de biofilm de Pseudomonas aeruginosa eliminada de la superficie del cupón.
Todos estos cupones se sonicaron a 45 kilohercios, 100% de potencia, y en configuración normal durante 30 más o menos cinco segundos. Estas imágenes fueron tomadas a un aumento de 12.5X por Lindsey Miller. Los cupones de la fila uno se sonicaron en agua de dilución, mientras que los cupones de la fila dos se sonicaron en caldo neutralizante DE.
Parece que queda menos biopelícula en los cupones que se sonicaron en caldo DE que contiene un surfactante en comparación con el agua de dilución. Los cupones A, B, E y F se sonicaron en un volumen de 10 mililitros, mientras que los cupones C, D, G y H se sonicaron en 40 mililitros de solución. Claramente hay menos biofilm en los cupones que fueron sonicados en los volúmenes más pequeños.
Los cupones A, C, E y G se sonicaron en el baño con tres tubos a la vez, mientras que los cupones B, D, F y H se sonicaron en un baño con 12 tubos a la vez. Parece que las muestras sonicadas con menos tubos exhibieron una cosecha de biopelícula superior. En última instancia, minimizar el volumen en los tubos, reducir el número de tubos sonicados a la vez y el uso de caldo neutralizante DE parecen contribuir a mejorar la recolección de biopelículas.
No existe un método perfecto para cosechar y desagregar la biopelícula, pero algunos enfoques son mejores para diferentes superficies y / o aplicaciones. Las técnicas demostradas en este video son los tres métodos más comunes según una revisión de la literatura. Estas tres técnicas pueden proporcionar un punto de partida para los investigadores.
Es importante tomarse el tiempo para validar el método de cosecha y desagregación elegido. Todos los equipos son ligeramente diferentes, por lo que incluso si el método se ha estandarizado, aún es prudente confirmar el proceso para el equipo utilizado. La investigación ha demostrado que las elecciones inadecuadas pueden conducir a resultados de pruebas sesgados.
Después de ver este video, se espera que esta información ayude a los investigadores a tomar decisiones más informadas sobre qué método usar y proporcione orientación sobre la mejora de la reproducibilidad para los tres tipos de superficie y las técnicas complementarias de cosecha y desagregación.
