Los autores agradecen a William Nance (Universidad de Michigan) para obtener ayuda en la formulación de los protocolos de crecimiento del biofilm y Juan Battista (Fluxion, San Francisco, CA) para obtener asesoramiento sobre cuestiones tecnológicas relacionadas con el sistema BioFlux. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH: R21DE018820 a AHR) y la Universidad de Michigan fondos iniciales para AHR

El protocolo de recogida de saliva se describe en este documento fue revisado por la Universidad de Michigan Institucional Review Board for Human Subject Investigación. NOTA: Con respecto a las revisiones institucionales de trabajo sujeto humano de este tipo, los acuerdos anteriores y los permisos deben ser recogidas de la institución anfitriona. En particular, dependiendo de la institución, el IRB o aprobación ética que tenga que ser tratado y aprobado antes de la recogida de saliva de voluntarios humanos puede continuar. Como una ayuda para la preparación de una aplicación, un útil NIH algoritmo / gráfico se puede encontrar aquí: <a href="http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf">http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf</a> 1. Preparación de la Canasta de saliva para el uso como un medio de crecimiento ambientalmente Germane <ol><li> Reclutar&gt; 5 personas para la donación de saliva. No tome ninguna información de identificación, asegúrese de no individudel als donará saliva si están enfermos o han tomado antibióticos orales en los últimos 3 meses, o han consumido alimentos o líquidos, con excepción del agua, en el 2 horas antes de la donación anterior. </li><li> Recoger saliva en tubos de plástico 50 ml. Agrupar la saliva recogida en un vaso de precipitados de plástico, manteniéndolo en hielo. No utilizar vidrio como polímeros en la saliva se adhieren a las superficies de vidrio internos. </li><li> Añadir ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 2,5 mM de una reserva de 100x. (Stock se congela en un solo uso alícuotas a -20 ° C). Se agita durante 10 min en un vaso de precipitados de plástico en hielo. </li><li> Con el fin de eliminar la materia en partículas, centrifugar la saliva agrupado de 30 min a 17.500 x g. </li><li> Diluir la saliva con 3 volúmenes de dH 2 O para dar un cuarto saliva concentrado. </li><li> Filter-esterilizar saliva usando 0,22 micras polietersulfona (PES), filtro de baja unión a proteínas. Utilice el filtro con gran superficie, o utilizar varios filtros pequeños de la zona. Mantenga la saliva en unarecipiente de plástico en el hielo mientras se filtra. </li><li> Congelar la saliva agrupado a -80 &#160; ° C en tubos de plástico de 50 ml hasta que se necesite para crecer bacterias. Cada tubo de plástico es para un solo uso y no debe contener más de 35 ml como cada pocillo de microfluidos tiene un máximo de 1,2 ml (1,2 ml x 24 pozos = 28,8 ml) y se necesita espacio en cada tubo como saliva se expande durante la congelación. </li><li> Para su uso, descongelar la saliva agrupado a temperatura ambiente. Una vez descongelado, filtro-esterilizar una vez más (0,22 micras polietersulfona, filtro de baja unión a proteínas para eliminar cualquier precipitado). </li></ol> 2. Preparación de la Canasta de saliva para el uso como un inóculo <ol><li> Reclutar&gt; 5 personas para la donación de saliva. No tome ninguna información de identificación, asegúrese de no individuos donan saliva si están enfermos, han tomado antibióticos orales en los últimos 3 meses, o haber consumido alimentos o líquidos, con excepción del agua, en el 2 horas antes de la donación anterior. Recoger samples más de 30 min. </li><li> Recoger saliva en tubos de plástico de 50 ml a temperatura ambiente y en común la saliva recogida en un vaso de precipitados de plástico a temperatura ambiente. </li><li> Diluir saliva combinado con glicerol esterilizada en autoclave grado reactivo en general para producir una acción con una relación final de 25% de glicerol, saliva que contiene células 75% [CCS]. </li><li> Congelar saliva a -80 ° C en 3 ml de un solo uso alícuotas hasta que se necesite. </li><li> Cuando sea necesario para inocular el sistema de microfluidos, alícuotas se descongelaron a temperatura ambiente y se agitaron suavemente en un vórtex durante 5 segundos antes de ser pipeteó en el sistema de microfluidos como se describe en el paso 3 del protocolo, a continuación. </li></ol> 3. El crecimiento de biopelículas orales múltiples especies <ol><li> Pretratamiento CFS <ol><li> La primera mano los canales de microfluidos BioFlux con SFC. Añadir 100 l de CFS a cada punto de venta también. Utilizando el software de control BioFlux, seleccione flujo &quot;manual&quot; y establecer canales de Tha &quot;B1-B24&quot;t se van a utilizar. </li><li> A continuación, establezca la cizalladura a 1,0 dinas / cm² y comenzar el flujo durante 2 minutos a temperatura ambiente para asegurar una distribución homogénea de los CFS a lo largo del canal. Asegúrese de que haya fluido en cada canal de entrada para verificar que el SFC fluía a través de todos los canales de manera uniforme. </li><li> Incubar la placa a temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Retire la solución / pretratamiento CFS que permanece en los pozos de salida y traslado a los pozos de entrada. Este volumen total de 100 l servirá para equilibrar en contra de la presión que se aplica al inóculo de la toma de bien. </li></ol></li><li> Inoculación <ol><li> Para cada salida bien, añadir 100 l de CCS inóculo. Colocar la placa de microfluidos en la placa de calor (temperatura ajustada a 37 ° C), seleccione manual en el software de control, y establecer el flujo de salida de los pozos a los pocillos de entrada (es decir, hacia atrás) en 1,0 dinas / cm² durante exactamente 6 seg. </li><li> Incubar la placa de microfluidos a 37 ° C durante 40 min para permitirpara la adherencia y el crecimiento de las bacterias en el inóculo inicial. </li></ol></li><li> Crecimiento Noche <ol><li> Para los canales inoculados se utilizan, aspirar el inóculo de residuos de cada uno de los pocillos de salida. Agregue hasta 1 ml de volumen total de CFS en cada uno de los pozos de entrada (se puede hacer en la parte superior del SFC existente). </li><li> Incubar la placa de microfluidos a 37 ° C, seleccione manual y establecer el programa se ejecute en el 0,2 dinas / cm² durante 20 horas. </li></ol></li><li> Prelavado a las manchas <ol><li> Aspirar todo el líquido de los pocillos de entrada y salida y añadir 100 l de PBS (pH 7,4) a cada uno de los pocillos de entrada. El flujo durante 20 minutos a 0,2 dinas / cm². </li></ol></li><li> Además de la mancha mezcla de <ol><li> Para la tinción de viabilidad celular hacer 100 l de mezcla de tinción para cada canal a ser manchada. En concreto, añadir 3 l de SYTO 9 y 3 l de yoduro de propidio por ml de PBS utilizando el kit de tinción viabilidad celular comercial como LIVE / DEAD. Esto generauna mezcla de tinción que contiene 10 mM SYTO 9 y 60 mM de yoduro de propidio. </li><li> Aspirar el PBS restante de los pozos de entrada y luego añadir 100 l de la mezcla mancha viabilidad celular a cada entrada también. Conjunto para fluir a 0,2 dinas / cm 2 y ejecutar la solución de entrada a la salida durante 45 min a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavado post-tinción <ol><li> Aspirar la mancha que queda en cada uno de los pozos de entrada y añadir 100 l de PBS a cada entrada bien. Conjunto para fluir a 0,2 dinas / cm² y ejecutar la solución de PBS de entrada a la salida durante 20 min a temperatura ambiente para eliminar cualquier exceso de colorante. </li></ol></li></ol> 4. Imagen de la colección, la representación 3D, y Análisis de Imágenes <ol><li> Utilice un microscopio de barrido láser confocal invertido (CLSM) para recoger datos de imagen biofilm del sistema de microfluidos. Asegúrese de que el CLSM es capaz de soportar el peso de la placa BioFlux, que puede alcanzar los 150 g. NOTA: Dada la moneda de diez centavosnsions de los canales de microfluidos, la necesidad de sensibilidad para discernir estructura del biofilm, y los requisitos para la detección de la señal de fluorescencia de intensidad variable, se ajustan a la CLSM con un 40X 1,25 NA lente del objetivo o uno con similar calidad óptica, ampliación y apertura numérica. </li><li> Estandarizar las puertas de captura de emisiones con ganancia y compensación de las mediciones que se mantienen constantes. Asegúrese de que la potencia del láser no supera el 25%, ya que esto puede resultar en foto-blanqueo. </li><li> Convertir archivos MBRC del EICA L mago F tipo ile (LIF) para OME (O pluma M edio A mbiente icroscopy) tipo de archivo. Esto permite una mayor facilidad de acceso y la compatibilidad entre los programas de software. Utilice el software disponible en el mercado, tales como, Imaris para convertir archivos de este tipo. </li></ol> Representación 3D de Imágenes / Cifras <ol start="4"><li> Una vez convertidos a formato OME, utilice el software disponible comercialmente como Imaris para construir las imágenesen 3D. Realice esta usando una combinación de opciones &quot;superan&quot; &quot;Easy3D&quot; y. Debe hacerse Atención a la señal de fondo y de umbral: NOTA. La función de histograma en Imaris se puede utilizar para obtener el rango de recogida y esta debe mantenerse constante entre las imágenes que se analiza. </li><li> Guarde las imágenes usando la función de &quot;instantánea&quot; y hacer una cuidadosa consideración a la resolución de imagen antes de guardar tipos de archivos. </li><li> Montar imágenes en figuras utilizando software de edición de imagen, tales como CorelDraw o Adobe Illustrator. </li></ol> Análisis de imágenes 3D para gráficos y tablas <ol start="7"><li> Utilice libremente disponible ImageJ 23 y COMSTAT / COMSTAT2 38 para el análisis de imágenes. Descargue los paquetes de http://rsb.info.nih.gov/ij/ y http://comstat.dk/, respectivamente. Haga que la actualización más reciente de Java instalada. NOTA: necesitará el JAVA plataforma de software para ser instalado prior para el uso del software de análisis de imagen. <ol><li> Utilice el software ImageJ con COMSTAT2 plugin para importar los archivos OME para cada imagen biofilm en el modo &quot;HyperStack&quot; y la vista con &quot;canales divididos&quot;. </li><li> Analizar individualmente los dos canales (rojo / propidio-yoduro / canal de ser muertos 0, / siendo VIVO canal verde / SYTO-9 1) mediante la función &quot;histograma&quot; de ImageJ. Esta función muestra el número total de píxeles de archivos OME 8 bits (que se muestran como &quot;recuento&quot;) en cada una intensidad de color de 0 a 255 (que se muestra como &quot;valor&quot;), siendo 0 píxeles sin señal (fondo) y 255 bienestar píxeles con saturación de la señal completa. </li><li> Exportar los datos en un programa de hoja de cálculo y estandarizar todos los valores de la señal mediante la ponderación de cada píxel de la intensidad de la señal correspondiente. Esto se realiza multiplicando el recuento total a una intensidad de señal dada por el valor de 8 bits numérico (0-255) de que la intensidad de la señal. </li><li> Sume todos los valores ponderados, 0-255, para ambos canales para cada imagen capturada biofilm. Tome la suma de los valores ponderados para ambos canales para determinar la señal total por ciento de cualquiera de los canales. Haga esto para determinar la relación familiar o ciento por ciento rojo y señal verde (es decir, el porcentaje &quot;muerto&quot; y el porcentaje de &quot;LIVE&quot; para cada tratamiento). </li><li> Realizar los análisis estadísticos, por ejemplo, utilizando dos colas t de Student modificado para varianza desigual. Los valores de p &lt;0,05 se consideraron significativos y los valores de p &lt;0,01 se consideran altamente significativa. </li></ol></li></ol> 5. Las células cosecha Biofilm para el Análisis Cultura-independiente <ol start="1"><li> Quite toda la saliva gastado y sin uso de pozos de entrada y salida. Lavar los pocillos con 1 ml de agua destilada estéril tres veces. </li><li> Añadir 100 l de agua destilada estéril a los pocillos de entrada y, utilizando la interfaz de control de software, pasar elagua destilada estéril hacia adelante a través de los canales a&gt; 8,0 dinas / cm 2 (caudal&gt; 745 l / h, cizalla de 800 s-1) durante al menos 5 minutos. Repita en la dirección inversa durante al menos 5 min y luego repetir el proceso hacia adelante y etapa de lavado inversa. </li><li> Compruebe por la luz o por microscopía de epifluorescencia (si se tiñeron células / marcado) para la eliminación del biofilm a fondo (Figura 2). Recoger el 100 l suspensión celular y se almacena a -80 ° C para el análisis de la cultura independiente. Un análisis costo-efectiva de composición de la comunidad se puede lograr mediante el uso de bacterias FLX pirosecuenciación amplicón etiqueta codificada (bTEFAP) utilizando el enfoque descrito en Nance et al. 20 </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+bacterial+infections+through+culture-independent+approaches.">Studying bacterial infections through culture-independent approaches.</a> Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).</li><li>Socransky, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+of+the+gingival+crevice+area+of+man.+I.+Total+microscopic+and+viable+counts+and+counts+of+specific+organisms.">The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms.</a> Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).</li><li>Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+adherence+and+colonization.+Microbiology+and+molecular+biology+reviews).">Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews).</a> MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).</li><li>Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+spatial+distribution+of+viable+and+nonviable+bacteria+in+hydrated+microcosm+dental+plaques+by+viability+profiling.">Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling.</a> Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).</li><li>Adams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+laboratory+model+to+assess+the+removal+of+biofilm+from+interproximal+spaces+by+powered+tooth+brushing.">Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing.</a> American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).</li><li>Ledder, R. G., McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+comparison+of+dentifrice+formulations+in+three+distinct+oral+microbiotas.">An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas.</a> Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).</li></ol>

A. H. R. and N.S.J. have received research awards from a variety of sources such as the National Institutes of Health (NIDCR), Colgate-Palmolive (Piscataway, NJ) and the Society for Applied Microbiology to fund research studies in their lab over the past five years. All other authors: none to declare.

Este documento pone de relieve los métodos pasos básicos necesarios para configurar y ejecutar un sistema de microfluidos de manera de permitir el desarrollo de biopelículas de especies múltiples orales derivados de agrupado saliva humana y cultivadas en esterilizada por filtración 25% agrupado saliva humana. Se dan aproximaciones para caracterizar el biofilm, pero cabe recordar que estos enfoques descritos son modificables y tecnologías adicionales como, por ejemplo, manchas o etiquetas se pueden introducir. Como...

<html> Los biofilms son comunidades complejas arquitectónicamente de bacterias, que se agrupan en las superficies 1. Estas comunidades típicamente contienen numerosas especies que interactúan entre sí dentro de la biopelícula 2. Biofilms orales, siendo la placa dental más conspicuo visualmente, son un problema persistente en los seres humanos y sus resultados para el desarrollo sin control en la generación de taxonómicamente diversas comunidades de especies múltiples 3. Las bacterias que componen estas comunidades diversas pueden ser de hasta 1.000 veces más resistentes a los antimicrobianos que sus homólogos (planctónicos) que flotan libremente 4-6. El no tratar estas comunidades biofilm orales, que pueden causar caries dental y la enfermedad periodontal, se ha traducido en una importante carga de salud pública: más de 500 millones de visitas a la oficina del dentista por año en los EE.UU., y una de aproximadamente 108 mil millones dólar para tratar o prevenir periodontal la enfermedad y la caries dental 7. contenido &quot;&gt;&quot; Si bien muchos microbiólogos abogan por estudiar el comportamiento microbiano en condiciones naturales, algunos de ellos lo hacen. Esto se debe a su estado de ánimo para vencer las dificultades que está constantemente minada por la atractiva facilidad de trabajar con cultivos de laboratorio. &quot;-Smith 8. En la actualidad, la investigación biofilm oral se llevó a cabo usando una variedad de in vivo e in vitro enfoques, cada uno con sus propias ventajas y desventajas 9,10. In vitro se acerca a menudo utilizan sistemas de biopelícula modelo que son relativamente fáciles de configurar, pero pueden carecer de clínica / relevancia en el mundo real 10,11. En vivo enfoques normalmente se basan en sistemas de modelos animales que pueden reproducir ciertos aspectos del entorno oral humana, pero una vez más sufren de limitaciones debido a diferencias en la anatomía, fisiología, microbiología e inmunología entre los animales y los seres humanos 12, 13. Cabe señalar que las biopelículas oralesTambién se pueden desarrollar en la superficie del esmalte, celebrada en un stent dentro de la boca de los voluntarios humanos, pero este enfoque es actualmente relativamente costoso y laborioso 14,15. En última instancia, los agentes o las tecnologías para mejorar la salud bucal nuevos se prueban en humanos en condiciones de ensayos clínicos controlados 11. En la actualidad, un modus operandi de uso frecuente para la identificación y evaluación de nuevos agentes de salud bucal es realizar primero los estudios de laboratorio para discernir la eficacia potencial y, a continuación, realizar estudios en animales y &quot;pruebas de campo&quot; que emplean los médicos para evaluar el éxito de la tecnología 9, 16,17. Desafortunadamente, los estudios de laboratorio tienden a basarse en sistemas modelo que ocupan una gran superficie, son tecnológicamente difícil de usar, y con frecuencia contienen simplifican comunidades de uno o como mucho unas pocas especies para derivar el potencial del mundo real que significa 10,18. Dado que los biofilms de la placa dental contienen múltiples especies y forma en un complex fluye medio salival, el desarrollo de biopelículas que contienen una o unas pocas especies en medios artificial es poco probable que genere comunidades que se comportan de una manera similar a las de un escenario del mundo real 10,19. Para hacer frente al tiempo, costo, los requisitos de formación, y la baja representatividad de los sistemas de biopelícula modelo de laboratorio en comparación con el medio ambiente del mundo real, recientemente hemos desarrollado un alto rendimiento y sistema de biopelícula relacionado con el medio ambiente 20 (Figura 1). El sistema se beneficia del uso de saliva libre de células agrupado humano (CFS) como agrupado saliva que contiene células bacterianas humano medio y sin tratar (CCS) como inóculo. Únicamente, el sistema también combina la tecnología de microfluidos, un microscopio de barrido láser confocal, y la diversidad bacteriana tecnología de análisis independiente del cultivo. Por lo tanto, el sistema modelo es pertinente para el medio ambiente (utilizando saliva como inóculo para crecer biopelículas de especies múltiples a 37 ° C en esterilizada por filtración fluyesaliva) y los biofilms orales contienen especies (incluyendo Streptococcus, Neisseria, Veillonella, y las especies Porphyromonas) en abundancias representante de las que se encuentran en la placa supragingival principios de los 20. Al considerar que este trabajo se describe el uso del modelo de sistema de nuevo desarrollo, se debe prestar especial atención a la fusión de un microscopio confocal de barrido láser (CLSM) microfluidos, y tecnologías de análisis de la diversidad cultura independiente. La unión de estas tecnologías por parte de nuestro grupo de investigación fue intencional y no sólo añade una capacidad de alto rendimiento para el modelo de sistema de nuevo desarrollo, sino que también permite a las preguntas que se les pide que no podría ser fácilmente abordado antes con otros sistemas. En primer lugar, CLSM tiene claras ventajas sobre la microscopía tradicional ya que permite el análisis tridimensional de biofilms. A menudo no apreciado, esto es extremadamente importante como biofilms son ingenio heterogéneah respecto a la composición de especies y la posición espacial, así como las condiciones fisiológicas se imponen en diferentes lugares espaciales dentro del biofilm 6,21. En concierto con software tridimensional de renderizado y software de análisis de imagen, la arquitectura biofilm, las relaciones espaciales entre las especies componentes, y el alcance de la matanza antimicrobiana puede ser analizado 22-24. Estas habilidades no son posibles con luz transmitida estándar o microscopía de epifluorescencia. A continuación, la microfluídica ha obtenido una atención especial en el campo de la microbiología, ya que permite el estudio de biofilms en condiciones cuidadosamente controladas (flujo, temperatura, pH, etc.) y sólo requiere pequeños volúmenes de líquido 25-27. Como punto de comparación, el crecimiento de un biofilm oral en la saliva humana dentro de un sistema modelo de celda de flujo (un sistema que se considera posiblemente el modelo de apoyo principal para muchos estudios de biofilm oral) durante 20 horas a una velocidad de flujo similar y de cizallamiento que el logradoen un sistema de microfluidos requiere por lo menos 200 ml, en comparación con 800 l en el dispositivo de microfluidos 28-31. Por lo tanto, un sistema modelo biofilm microfluidos permite el estudio de los materiales cantidad limitada bajo condiciones definidas. Por último, la tecnología de pirosecuenciación se ha optimizado en la última década para requerir sólo pequeñas cantidades de material para llevar a cabo un análisis de la comunidad y es suficientemente versátil para controlar la profundidad de la secuenciación para obtener la identidad de las especies del biofilm incluso raros. El uso de esta tecnología, tales como bacterias etiqueta codificada FLX amplicón pirosecuenciación (bTEFAP), ha permitido preguntas pertinentes sobre la ecología de las biopelículas que se abordarán 32,33. Tales preguntas imbuidos dificultades en el pasado, cuando pirosecuenciación no estaba disponible debido al tiempo y los costes necesarios para crear bibliotecas de plásmidos y las complejas medidas tecnológicas y analíticas necesarias para obtener datos de 33,34. Por supuesto, una gran ventaja con independiente del cultivo apenfoques, tales como la pirosecuenciación, es que las especies bacterianas que no se pueden cultivar en el aislamiento dentro de los medios de laboratorio convencional (es decir, especies viables pero no cultivables) pueden ser cultivadas e identificadas en el sistema de modelo y su abundancia relativa en la comunidad cuantificaron 35, 36 . Para añadir perspectiva, tan pronto como 1963, el difunto Sigmund Socransky estima que aproximadamente el 50% de las bacterias en el material aisladas de la grieta gingival oral humana no podía cultivarse usando las condiciones de crecimiento de laboratorio 37. El objetivo de este trabajo es describir los métodos de enfoque para desarrollar biofilms de especies múltiples orales en un sistema de microfluidos disponible comercialmente (BioFlux) en: (i) las condiciones representativas de la cavidad oral humana y (ii) con una composición y abundancia de especies que es comparable a la placa supragingival. Además, utilizando tanto software freeware y comercial, destacamos biofilm lo básicomedidas arquitectura se pueden derivar de los datos CLSM, con un enfoque en los enfoques para cuantificar la biomasa biopelícula, la rugosidad y la viabilidad (basadas en la tinción Live / Dead). Por último, se describen los pasos necesarios para cosechar material de biopelícula para el análisis de la diversidad por bTEFAP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="951">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:525px;">SUPPLIES AND EQUIPMENT</td>
			<td style="width:224px;">AVAILABLE FROM COMPANY</td>
			<td style="width:203px;">CATALOG NUMBER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorval ultracentrifuge&#160; (SS-34 compatible)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Unit-dependent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific SS-34 Rotor&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>28-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific Inc</td>
			<td>23-290-065</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>73520-986&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>NC0542269</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioFlux microfluidic system</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>Bioflux 200 system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux 24-channel plate</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>910-0004</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>10010023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIVE/DEAD stain (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SPE or eqivalent system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrosequencing facilities</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Decon SaniHol 70 Ethanol Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Ultra Low Temperature Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips (20, 200, and 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux dedicated software</td>
			<td>Bioflux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica SPE</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COMSTAT/COMSTAT 2</td>
			<td colspan="2">Freeware (http://www.comstat.dk/)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms

No son pocos los de alto rendimiento en sistemas in vitro que faciliten el desarrollo de biopelículas de especies múltiples que contienen numerosas especies comúnmente detectados dentro en vivo biofilms orales. Además, un sistema que utiliza la saliva humana natural como la fuente de nutrientes, en lugar de medios artificiales, es particularmente deseable con el fin de apoyar la expresión de propiedades celulares y biofilm específica que imitan las comunidades in vivo. Se describe un método para el desarrollo de múltiples especies biofilms orales que son comparables, con respecto a la composición de especies, a la placa dental supragingival, en condiciones similares a la cavidad oral humana. En concreto, este artículo se describen los métodos de cómo un sistema de microfluidos disponible en el mercado puede ser adaptado para facilitar el desarrollo de múltiples especies biofilms orales derivados de y crecido dentro de la saliva agrupado. Además, una descripción de cómo el sistema puede ser utilizado en conjunción con un confocal microscopio de barrido láser para generar 3-D reconstrucciones biofilm para los análisis de arquitectura y de viabilidad que se presentará. Dada la amplia diversidad de microorganismos que crecen dentro de los biofilms en el sistema de microfluidos (incluyendo Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, y Porphyromonas), un protocolo se presentará también la descripción de cómo cosechar las células del biofilm para más subcultura o la extracción de ADN y análisis. Se tratarán los límites tanto del sistema de biopelícula de microfluidos y los análisis de datos actualizadas con tecnología de última generación. En última instancia, se prevé que este artículo le proporcionará una técnica de línea de base que va a mejorar el estudio de las biopelículas orales y ayudar en el desarrollo de tecnologías adicionales que se pueden integrar con la plataforma de microfluidos.

Representación 3D de biopelículas Los resultados representativos se muestran en la Figura 3. Una herramienta útil en el software Imaris es la opción para examinar cada rebanada de la pila de biofilm recogido y combinarlos para crear reconstrucciones tridimensionales. Además, los efectos de sombreado artificiales se pueden añadir para ayudar a interpretar visualmente estructuras tridimensionales. Los biofilms prestados pueden orientarse en cual...

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Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

El objetivo de este documento métodos es describir el uso de un sistema de microfluidos para el desarrollo de biopelículas de especies múltiples que contienen especies típicamente identificados en la placa dental supragingival humano. Métodos para describir la arquitectura de biopelículas, la viabilidad de biopelículas, y un acercamiento a la cosecha biofilm para los análisis dependientes de la cultura o la cultura independiente se destacan.

El uso de un gran procesamiento<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema de microfluidos para el Desarrollo de biopelículas orales múltiples especies

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

13.4K vistas.  The University of Michigan.  El objetivo de este documento métodos es describir el uso de un sistema de microfluidos para el desarrollo de biopelículas de especies múltiples que contienen especies típicamente identificados en la placa dental supragingival humano. Métodos para describir la arquitectura de biopelículas, la viabilidad de biopelículas, y un acercamiento a la cosecha biofilm para los análisis dependientes de la cultura o la cultura independiente se destacan. 

Video: Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Investigación

Bioingeniería

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Proteínas de alto rendimiento del generador de expresiones utilizando una plataforma de microfluidos

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Análisis sistemático de<em&gt; In Vitro</em&gt; Celda balanceo Utilizando un sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or lethality. However, the probability of a synthetic small molecule being bioactive is low; therefore, thousands of molecules must be tested in order to find those of interest. Liquid handling robotics systems are designed to handle large numbers of samples, increasing the speed with which a chemical library can be screened in addition to minimizing/standardizing error. To achieve a high-throughput forward chemical genetics screen of a library of 50,000 small molecules on Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocols using a bench-top multichannel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement. With these protocols, 3,271 small molecules were discovered that caused visible phenotypic alterations. 1,563 compounds induced short roots, 1,148 compounds altered coloration, 383 compounds caused root hair and other, non-categorized, alterations, and 177 compounds inhibited germination.

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A high throughput screen of synthetic small molecules was conducted on the model plant species, Arabidopsis thaliana. This protocol, developed for a liquid handling robot, increases the speed of forward chemical genetics screens, accelerating the discovery of novel small molecules affecting plant physiology.

Optimizar el uso de un Robot de manipulación de líquidos para llevar a cabo un alto rendimiento adelante química genética pantalla de Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

Identificación de alto rendimiento de la resistencia a Pseudomonas syringae pv. Tomate en tomate usando el ensayo de inundación de plántulas

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...