Damos las gracias a Matt Parsek en la Universidad de Washington (Seattle, WA) para proporcionar P. aeruginosa y E. cepas de E. coli y Roger Nokes de la Universidad de Canterbury (Nueva Zelanda) para proporcionar acceso a software Arroyos. Este trabajo fue apoyado por el subsidio R01AI081983 de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. Confocal de imágenes se realizó en las instalaciones de la Northwestern Imaging Biológica (BIF).

Configuración de la célula 1. Flujo y Inoculación NOTA:. Utilice una celda de flujo de microfluidos de doble entrada se describe en Song et al, 2014 14 para crecer biopelículas. Esta celda de flujo es capaz de crear gradientes químicos lisas bien definidos. El diseño de la célula de flujo se muestra en la figura 1 y el flujo de fabricación de células se ha descrito anteriormente en Song et al., 2014 14. Aquí detalle nuestros métodos mediante el uso de P. aeruginosa y E. coli para formar biopelículas, pero otras especies puede ser adecuado también. Se utilizó P. aeruginosa PAO1- gfp, que expresa constitutivamente una proteína fluorescente verde (GFP), como un organismo modelo para el desarrollo de biopelículas. Además, se utilizó E. coli DH5a para formar biopelículas de especies mixtas con P. aeruginosa. P. aeruginosa y E. cepas de E. coli se cultivaron en placas de agar LB. <ol><li> Prepare la celda de flujo usando polidimetilsiloxano (PDMS) unido a uncubreobjetos de vidrio a través del tratamiento con plasma de oxígeno como se describe en 14. Las dimensiones de la cámara de celda de flujo son 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (longitud x anchura x profundidad). </li><li> Preparar modificado medio de crecimiento FAB 15. Para observar el crecimiento de biopelícula bajo un gradiente nutricional dentro de la celda de flujo, la introducción de Fab modificado medio 15 con glucosa 0,6 mM en una entrada y introducir medio FAB sin ninguna fuente de carbono a través de la otra entrada. Filtro-esterilizar (tamaño de poro = 0,2 micras) la solución de glucosa de valores (60 mM) antes de añadir al medio de FAB. También autoclave el medio FAB con el ciclo 1 (líquido, 15 min; 121 ° C, 17 psi) antes de su uso. </li><li> Esterilizar el sistema de flujo. Antes de la inoculación, autoclave toda la trayectoria de flujo (botellas medianas, tubos, trampas de burbujas, las células de flujo) usando el ciclo 1, a excepción de las válvulas de tres vías de plástico desechables (y pre-esterilizados) situados aguas arriba de la celda de flujo. (Válvulas de tres formas se utilizan para inyectar células cultura, trazador fluorescente y microperlas.) Para evitar la contaminación durante el montaje, cubre todas las aberturas de tubos y conectores con papel de aluminio o bolsas de autoclave antes de la esterilización en autoclave. </li><li> Conectar el sistema de flujo. Montar los componentes del sistema de celda de flujo cuidadosamente (ver video para el montaje sistema de flujo) y entregar medio de crecimiento a la célula de flujo a través de una bomba peristáltica que controla con precisión la velocidad de flujo. </li><li> Preparar el cultivo de células para la inoculación mediante la transferencia de una colonia de P. aeruginosa o E. coli a partir de placas de LB a 3 ml de caldo LB y agitar el cultivo O / N a 225 rpm y 37 ° C. Diluir los cultivos de células S / N en 1 ml esterilizados agua a una DO final 600 = 0,01 como el inóculo. (Cultura y diluir las bacterias en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.) </li><li> Para los experimentos con las biopelículas de especies mixtas, diluir los dos cultivos bacterianos a una relación de 1: 1 en 1 ml con una DO 600 = 0,01 equivalente para cada bacteria. </li><li> Inocular la celda de flujo. Inyectar 1 ml de inóculo a la entrada de la celda de flujo de la válvula de tres vías. Después de la inyección, una pausa en el flujo durante 1 hora para permitir que las células bacterianas que se adhieren a la cubierta de vidrio. (Asegúrese de que la celda de flujo se coloca con el lado cubreobjetos hacia abajo para permitir que las células suspendidas se asienten en el cubreobjetos.) </li><li> Después de 1 hr, reanudar el flujo y bombear el medio de crecimiento a la célula de flujo a una velocidad constante de 0,03 ml / min para cada entrada durante 3 días. </li></ol> 2. Caracterización de Biofilm Desarrollo en respuesta a gradientes de nutrientes Utilizando Microscopía Confocal NOTA: P. aeruginosa se ​​pueden obtener imágenes con GFP expresada constitutivamente, pero E. coli en las biopelículas de especies mixtas debe ser imaginada por counterstaining. <ol><li> Tenga en cuenta las biopelículas de 3 días usando microscopía confocal. Para los resultados representativos, observar biofilms utilizando un microscopio confocal con un objetivo 63X. Antes de la proyección de imagen, marcala célula de doble entrada de flujo con una rejilla en el lado de cubierta de vidrio. (El propósito de esta rejilla es permitir que el experimentador para localizar las regiones de formación de imágenes dentro de la cámara de la celda de flujo.) </li><li> Para contrateñir, diluir 10 l de rojo fluorescente colorante de ácidos nucleicos de células permeante, tales como mancha nucleico fluorescente verde ácido, tal como STYO 62, solución madre (1 mM) en 990 l de agua esterilizada y luego inyectar lentamente la mancha diluida utilizando una jeringa en la cámara de la celda de flujo de la válvula de tres vías aguas arriba. Mantenga la celda de flujo estancado y en la oscuridad durante 30 min, luego reanudar el flujo para lavar la mancha no unida durante 15 min. </li><li> Realizar imagen confocal. Active el 488 nm láser de argón para la excitación y la emisión de canales de recogida de las buenas prácticas agrarias (500-535 nm) y la mancha de ácido nucleico (por colorante de ácidos nucleicos fluorescente verde, 650-750 nm). Ajustar las ganancias y las compensaciones para los dos canales para tener imágenes brillantes y limpias. Seleccione xyz y el modo de imágenes simultáneas. Utilice el mando de control de z para identificar la parte inferior y la parte superior de la biopelícula en el campo. Ajuste el z-paso para 0,5 micras para la adquisición de una imagen pila 3-D. (Para garantizar una alta calidad de imagen, utilice un promedio de la línea de cuatro para la adquisición de imágenes.) </li><li> Para asignar los patrones espaciales de desarrollo de la biopelícula dentro de la celda de flujo, las biopelículas de la imagen en tres o más longitudinal (x) las distancias a lo largo de la entrada de la celda de flujo, y a las tres transversal (y) posiciones relativas al gradiente nutricional impuesta, como se muestra en la Figura 1 . </li></ol> 3. Caracterización de solutos Interna Transporte por inyecciones de trazador fluorescente Conservador NOTA: Un indicador fluorescente conservador, como Cy5, puede ser utilizado para caracterizar los patrones de transporte de solutos dentro de la biopelícula. <ol><li> Disolver Cy5 (Mono-reactiva NHS Ester) en agua a una concentración final de 10 mg / ml como una solución madre. La solución madre, Cy5 en un congelador a -20ºC. NOTA: Como Cy5 es luz-sensitive, almacenar, diluir e inyectar soluciones Cy5 en la oscuridad. </li><li> Antes de las inyecciones de trazador fluorescente, tomar una imagen de la pila 3-D de la biopelícula de 3 días con la microscopía confocal (con un objetivo 63X). (Regiones anchas de colonias biofilm son ideales para las observaciones de series de tiempo de transporte de tinte.) También elegir un plano z con colonias bien separadas para imágenes (como se muestra en la Figura 5A). </li><li> Para cada experimento de inyección Cy5, diluir 2 l de la solución madre Cy5 en 998 l de agua esterilizada para producir una solución de inyección que tiene una concentración Cy5 de 20 mg / ml. </li><li> Parar la bomba para pausar el flujo e inyectar la solución en el Cy5 aguas arriba de la celda de flujo usando una jeringa a través de la válvula de 3 vías. (Es importante para evitar las burbujas de aire entren en la trayectoria de flujo mientras se inyecta. Trampas de burbujas deben mantenerse abierta durante la inyección de nuevo.) </li><li> Después de inyectar la solución Cy5, cerrar las trampas de burbujas, ajuste la válvula de 3 vías, y reinicie elbomba para suministrar la solución Cy5 se inyecta en la celda de flujo. </li><li> Cambiar el modo de imagen confocal para XYT. Activar canales Cy5 y GFP bajo el modo de imágenes simultáneas. Ajustar la configuración confocal en intensidad Cy5 (intensidad del láser, la ganancia y offset) para evitar la saturación de señales, lo cual es crítico para la cuantificación. (Se prefiere alta resolución temporal para la visualización de penetración del colorante. Sin embargo, el escaneo rápido disminuye la calidad de la imagen.) Elija la velocidad de exploración adecuada y media línea para equilibrar el tiempo de resolución de la imagen y la calidad de imagen. Para este protocolo utilizar un promedio de la línea de cuatro y una velocidad de 0,15 Hz. </li><li> Reanudar el flujo para entregar Cy5 en la célula de flujo (todavía a un caudal de 0,03 ml / min). Al mismo tiempo la hora de inicio de la serie de imagen confocal. </li><li> Cuantificar la penetración Cy5 por radialmente promedio de intensidad Cy5 dentro de una colonia biofilm circular 2-D. Para promedio, primero identificar el borde de un clúster de biofilm, a continuación, generar un mapa de distancia para una sección de 2-D de la agrupaciónY, finalmente, los patrones radiales promedio de las intensidades de Cy5 para generar una curva de penetración (véase la figura 6). <ol><li> Para darse cuenta computacionalmente paso 3.8, utilice Biospa (Análisis del patrón espacial Biofilm) paquete de software (no publicado, paquete de software y manual disponibles bajo petición) u otros programas de análisis de imágenes. </li><li> Para utilizar Biospa, primero importar una imagen definida en Biospa. A continuación, seleccione el umbral adecuado para los canales de las buenas prácticas agrarias y Cy5 para que las imágenes binarias. En el menú de análisis / cálculo, seleccione Análisis Avanzado y luego Análisis Difusión. Utilice el canal de las buenas prácticas agrarias para definir el borde de un clúster y utilizar la herramienta de polígono para seleccionar un clúster como la región de interés (ROI). </li><li> Haga doble clic en el cluster biofilm seleccionado para realizar el análisis de la difusión. Guardar los resultados del análisis de difusión y calibrar la intensidad de Cy5 a la concentración de Cy5 usando una curva de calibración. <ol><li> Para generar Cy5 curva de calibración de concentración, medir intensidades de Cy5 sobre un conce Cy5gradiente ntration bajo microscopía confocal. (Intensidad Cy5 y la concentración tienen una relación lineal.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Caracterización de la Rodeando Flow Field de Seguimiento fluorescente Partículas NOTA: Las partículas fluorescentes, como microperlas fluorescentes, se puede utilizar para caracterizar el campo de flujo alrededor de las biopelículas. Campo de flujo alrededor de biofilms puede calcularse a partir de las observaciones de series de posiciones de las partículas que utilizan el software de seguimiento de partículas velocimetría. Los resultados mostrados aquí fueron obtenidos con el software Streams 2.02 paquete de 16 (descarga de software y guía del usuario disponible en <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol><li> Diluir las microperlas fluorescentes (diámetro ~ 1 mM) en agua esterilizada a una concentración de sólidos final de 0,2% y un volumen final de 0,5 ml. Vortex para asegurarse de que las microperlasson bien dispersado. </li><li> Inyectar y entregar las microperlas fluorescentes diluido en la celda de flujo siguiendo los procedimientos de los pasos 3.3 a 3.5. Para permitir un seguimiento preciso de la trayectoria de la partícula, utilice una tasa relativamente baja de flujo (0,01 ml / h para los resultados de rastreo de partículas en este documento). </li><li> Cambie la configuración confocal al modo XYT para seguir el movimiento de las partículas en un z-slice y tomar imágenes de series de tiempo. (A la velocidad de fotogramas de 1 Hz se utilizó para los resultados representativos que se muestran en este documento.) Repetir la inyección de partículas y la imagen en diferentes lugares z para generar flujo de campo 3-D. </li><li> Pre-proceso de la serie temporal de imágenes confocal restando la señal de fluorescencia de fondo (la señal en la primera imagen adquirida del conjunto de imágenes) utilizando ImageJ (descargar el software y el manual disponible en <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) u otros programas. </li><li> En ImageJ, abrir la primera imagen de un conjunto de imágenes y luego importar el conjunto de imágenes. Bajo Proceso / Imagen Calculator, reste la primera imagen de la imagen de conjunto. Guarde el conjunto de imágenes pre-procesado. </li><li> Para calcular los vectores de flujo, la importación de series de tiempo confocal de imágenes en Streams 2.02. En &quot;vista del proceso abierto&quot;, seleccionar y ejecutar &quot;Identificar partículas&quot;. Utilice umbral adecuado para identificar partículas. Utilice 0,5 y 5 micras de diámetro como umbrales mínimos y máximos de 1 micras partículas. </li><li> A continuación, en &quot;vista del proceso abierto&quot;, seleccionar y ejecutar &quot;análisis de tuberías PTV&quot; para generar trayectorias de las partículas. Compruebe las trayectorias de las partículas para ver si representan el movimiento de las partículas. Por último, seleccionar y ejecutar &quot;Crear campo de velocidad&quot; para generar un mapa vectorial de flujo. </li></ol>

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	<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability.">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).</li><li>Costerton, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Biofilms+in+Nature+and+Disease.">Bacterial Biofilms in Nature and Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li><li>Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+microbial+biofilms+to+ecosystem+processes+in+stream+mesocosms.">Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms.</a> Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+A+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections.</a> Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).</li><li>Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hydrodynamics+and+nutrients+on+biofilm+structure.">Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure.</a> J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).</li><li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+deformation+of+bacterial+biofilms+caused+by+short-term+fluctuations+in+fluid+shear:+An+in+situ+investigation+of+biofilm+rheology.">Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology.</a> Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).</li><li>Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+growth+conditions+on+biofilm+development+and+mass+transfer+at+the+bulk/biofilm+interface.">Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface.</a> Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Convection+around+biofilms.">Mini-review: Convection around biofilms.</a> Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Flemming, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorption+sites+in+biofilms.">Sorption sites in biofilms.</a> Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Flow+in+Heterogeneous+Biofilms.">Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).</li><li>Schultz, M. P., Swain, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+biofilms+on+turbulent+boundary+layers.">The effect of biofilms on turbulent boundary layers.</a> J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).</li><li>Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Responses+to+Smooth+Flow+Fields+and+Chemical+Gradients+in+Novel+Microfluidic+Flow+Cells.">Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).</li><li>Shrout, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+quorum+sensing+and+swarming+motility+on+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+is+nutritionally+conditional.">The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional.</a> Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).</li><li>Maxworthy, T., Nokes, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+gravity+currents+propagating+down+slopes.+Part+1.+The+release+of+a+fixed+volume+of+heavy+fluid+from+an+enclosed+lock+into+an+open+channel.">Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel.</a> J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+experimental+measurements+of+effective+diffusive+permeabilities+and+effective+diffusion+coefficients+in+biofilms.">A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms.</a> Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).</li><li>Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironments+and+distribution+of+nitrifying+bacteria+in+a+membrane-bound+biofilm.">Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm.</a> Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).</li><li>Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsensors+as+a+tool+to+determine+chemical+microgradients+and+bacterial+activity+in+wastewater+biofilms+and+flocs.">Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs.</a> Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).</li><li>Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Biofilm+Structures+on+Oxygen+Distribution+and+Mass-Transport.">Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport.</a> Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).</li><li>Liu, Y., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+role+of+hydrodynamic+shear+force+in+the+formation+of+biofilm+and+granular+sludge.">The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge.</a> Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Planar+Flow+Cell+for+Studies+of+Biofilm+Heterogeneity+and+Flow-Biofilm+Interactions.">A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions.</a> Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Tseng, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+protects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+by+limiting+the+penetration+of+tobramycin.">The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin.</a> Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).</li><li>Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Measurement+of+Chlorine+Penetration+into+Biofilms+during+Disinfection.">Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection.</a> Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hemos demostrado una serie de métodos para caracterizar tres importantes interacciones biofilm-ambiente: respuesta biofilm a gradientes químicos, los efectos de la formación de biopelículas en el microambiente que rodea el flujo, y la heterogeneidad biofilm resultante de las limitaciones de transporte interno. En primer lugar, demostramos el uso de una celda de flujo de microfluidos novedoso para imponer un gradiente químico bien definido para el desarrollo de biopelículas. Para genera...

Los microorganismos se adhieren a las superficies y formar biopelículas - agregados de células encerradas en una matriz extracelular-polímero 1. Las biopelículas se comportan de manera muy diferente a partir de células microbianas individuales, porque biofilms tienen heterogeneidad espacial dramática resultante de una combinación de limitaciones de transporte de solutos internos y las variaciones espaciales en el metabolismo celular 2,3. Las concentraciones de oxígeno y de nutrientes disminuyen drásticamente en la interfaz entre biofilm y fluido circundante y se agotan más dentro en la biopelícula 2. Las variaciones espaciales en la respiración de biopelículas y la síntesis de proteínas también pueden ocurrir como respuesta al oxígeno localizada y la disponibilidad de nutrientes 2. En los ambientes acuáticos y del suelo, la mayoría de las bacterias viven en los biofilms. Biofilms naturales llevan a cabo importantes procesos biogeoquímicos incluyendo el ciclo del carbono y nitrógeno y reduciendo metales 4,5. Clínicamente, la formación de biopelículas es responsble para pulmonar prolongada e infecciones urinarias 6. Infecciones biofilm asociado son muy problemático porque las células en biofilms tienen muy alta resistencia a los antimicrobianos en comparación con sus homólogos planctónicas 6. Debido a que las biopelículas son importantes en diversos entornos, una cantidad sustancial de investigación se ha centrado en la comprensión de los factores ambientales que controlan las actividades de biofilm y la heterogeneidad espacial en biofilms y el microambiente que rodea. Estudios previos han encontrado que el desarrollo de biopelículas está fuertemente regulada por una serie de factores ambientales: biopelículas se desarrollan diferentes morfologías en diversas condiciones de flujo; oxígeno y nutrientes disponibilidad influencia morfología de la biopelícula; y la tensión de cizallamiento hidrodinámico afecta a la unión de las células planctónicas a las superficies y el desprendimiento de las células de las biopelículas 7-9. Por otra parte, el estado de flujo externo influye en la entrega de los sustratos into y dentro de los biofilms 10. El crecimiento de biofilms también altera rodea condiciones físicas y químicas. Por ejemplo, el crecimiento de biopelículas conduce a la reducción local de oxígeno y nutrientes 2; biofilms se acumulan compuestos inorgánicos y orgánicos desde el ambiente circundante 11; y grupos de biofilm desvían el flujo y el aumento de superficie de fricción 12,13. Debido a que las biopelículas interactúan con su entorno de maneras muy complejas, es fundamental para obtener simultáneamente información sobre las propiedades del biofilm y las condiciones ambientales, y los enfoques multidisciplinarios necesita ser utilizado para caracterizar exhaustivamente interacciones biofilm y medio ambiente. Aquí les presentamos una serie de métodos integrados para caracterizar los patrones espaciales en el crecimiento microbiano en mono-especies y biofilms de doble especies bajo un gradiente nutricional impuesta, y observar la consiguiente modificación de la química local y microambiente fluido. Nos FIRst describen el uso de una celda de flujo microfluídico de doble entrada recientemente desarrollado para observar el crecimiento de biopelícula bajo gradientes químicos bien definidos. A continuación, demuestran el uso de esta celda de flujo de microfluidos para observar el crecimiento de dos especies de bacterias, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, en biofilms bajo un rango de condiciones nutricionales. Se muestra cómo en la visualización in situ de propagación trazador fluorescente en colonias de biopelícula puede ser utilizado para evaluar cuantitativamente los patrones de transporte de solutos en biofilms. Por último, se muestra cómo microescala velocimetría de seguimiento de partículas, realizado con microscopía confocal, se puede utilizar para obtener el campo de flujo local alrededor de las biopelículas que crecen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:89px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">Miniplus 3</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow</td>
			<td style="width:89px;">Gilson</td>
			<td style="width:104px;">F117934</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock</td>
			<td style="width:89px;">Smiths Medical&#160;</td>
			<td style="width:104px;">MX9311L</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels</td>
			<td style="width:89px;">ML Solar LLC</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45</td>
			<td style="width:89px;">VWR</td>
			<td>16157-191</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">C-FLEX Tubing</td>
			<td style="width:89px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:104px;">06422-02</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">1 mL TB Syringe</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">309659</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Polymer Tubing</td>
			<td style="width:89px;">IDEX</td>
			<td style="width:104px;">1520G</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Sterile Intramedic Luer Stub Adapter</td>
			<td style="width:89px;">Clay Adams</td>
			<td style="width:104px;">427564</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">PrecisionGlide Needle</td>
			<td style="width:89px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">305195</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:89px;">HACH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">Syringe filters- sterile (0.2 &#956;m)</td>
			<td style="width:89px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:104px;">09-719A</td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:227px;">MAXQ Shaker</td>
			<td style="width:89px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:167px;">Flow cell setup and inoculation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Ammonium sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4418</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">RES20908-A7</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Monobasic potassium phosphate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P5655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">S7653</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Magnisium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M8266</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C5670</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Calcium sulfate dihydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C3771</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">215422</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Manganese(II) sulfate monohydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">M7634</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Copper(II) sulfate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">451657</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">Z0251</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Cobalt(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Sodium molybdate</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">243655</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Boric acid</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">B6768</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Dextrose</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">D9434</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Luria Bertani Broth</td>
			<td style="width:89px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">L3022</td>
			<td>Growth media</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">TCS SP2 Confocal Microscopy</td>
			<td style="width:89px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:227px;">SYTO 62</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">S11344</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:227px;">Cy5</td>
			<td style="width:89px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">PA15100</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Red Fluorescent (580/605) FluoSphere</td>
			<td style="width:89px;">Life Technology</td>
			<td style="width:104px;">F-8801</td>
			<td>Fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">BioSPA</td>
			<td style="width:89px;">Packman Lab</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">ImageJ</td>
			<td style="width:89px;">NIH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">Volocity</td>
			<td style="width:89px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Streams 2.02</td>
			<td style="width:89px;">University of Cantebury</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Image Processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for characterizing the co-development of biofilm and habitat heterogeneity

Los biofilms son comunidades microbianas unido a la superficie que tienen estructuras complejas y producen heterogeneidades espaciales significativos. El desarrollo del biofilm está fuertemente regulada por el flujo que rodea y el entorno nutricional. El crecimiento de biopelículas también aumenta la heterogeneidad de la microambiente local mediante la generación de campos de flujo complejos y patrones de transporte de solutos. Para investigar el desarrollo de la heterogeneidad en los biofilms y las interacciones entre los biofilms y su micro-hábitat local, crecimos biofilms mono-especies de Pseudomonas aeruginosa y biofilms de doble especies de P. aeruginosa y Escherichia coli bajo gradientes nutricionales en una celda de flujo de microfluidos. Proporcionamos protocolos detallados para la creación de gradientes de nutrientes dentro de la célula de flujo y para el cultivo y visualizar el desarrollo de biopelículas en estas condiciones. También protocolos actuales para una serie de métodos ópticos para cuantificar patrones espaciales en la estructura de la biopelícula, distri fluirbuciones sobre las biopelículas, y el transporte de masa alrededor y dentro de colonias de biopelícula. Estos métodos son compatibles con una amplia investigación sobre el co-desarrollo de biopelículas y la heterogeneidad de hábitats.

La celda de flujo microfluídico de doble entrada permite la observación del crecimiento del biofilm en virtud de un gradiente químico bien definido formado por la mezcla de dos soluciones dentro de la cámara de flujo. El gradiente químico resultante se observó anteriormente por inyección de colorante y caracteriza en detalle por Song et al. 14. Gradientes de concentración lisas se formaron en la dirección transversal, como se muestra en la Figura 1. El perfil de concentraci?...

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Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Los métodos para la caracterización de la Co-desarrollo de la biopelícula y Hábitat Heterogeneidad

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

methods-for-characterizing-co-development-biofilm-habitat

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K vistas.  Northwestern University. Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies. 

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Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To this end, our laboratory has applied the principles of nanomedicine to simplify ART regimens and as such reduce toxicities while improving compliance and drug pharmacokinetics. Simple and reliable methods for manufacturing nanoformulated ART (nanoART) are shown. Particles of pure drug are encapsulated by a thin layer of surfactant lipid coating and produced by fractionating larger drug crystals into smaller ones by either wet milling or high-pressure homogenization. In an alternative method free drug is suspended in a droplet of a polymer. Herein, drug is dissolved within a polymer then agitated by ultrasonication until individual nanosized droplets are formed. Dynamic light scattering and microscopic examination characterize the physical properties of the particles (particle size, charge and shape). Their biologic properties (cell uptake and retention, cytotoxicity and antiretroviral efficacy) are determined with human monocyte-derived macrophages (MDM). MDM are derived from human peripheral blood monocytes isolated from leukopacks using centrifugal elutriation for purification. Such blood-borne macrophages may be used as cellular transporters for nanoART distribution to human immunodeficiency virus (HIV) infected organs. We posit that the repackaging of clinically available antiretroviral medications into nanoparticles for HIV-1 treatments may improve compliance and positively affect disease outcomes.

Nanoparticles of indinavir, ritonavir, efavirenz and atazanavir were manufactured using wet milling, homogenization and ultrasonication. These nanoformulations, collectively termed nanoformulated antiretroviral therapy (nanoART), assessed macrophage-based drug delivery. Monocyte-derived macrophage nanoART uptake, retention and sustained release were determined. These preliminary studies suggest the potential of nanoART for clinical use.

Métodos de desarrollo para el transporte de macrófagos transmitidas por la sangre de los medicamentos antirretrovirales Nanoformulated

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Investigación

Bioingeniería

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

Candida albicans biofilm Chip (Ca BChip) para la selección de alto rendimiento antifúngico

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Métodos para la auto-integración de Megamolecular Biopolímeros en el Aire-LC Interfaz de secado

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Dos métodos de descelularización de tejidos vegetales para aplicaciones de ingeniería de tejidos

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Evaluación integral de la efectividad y seguridad de la entrega de drogas orientada a Placenta utilizando tres métodos complementarios

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Dispositivos eléctricos y de campo magnético para la estimulación de tejidos biológicos

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Formulación y caracterización de nanopartículas lipídicas para la administración de genes utilizando una plataforma de mezcla microfluídica

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...