Mi laboratorio ha estado trabajando en la investigación de COVID-19, y recientemente hemos desarrollado un nuevo ensayo que nos permitió detectar de forma rápida y precisa los anticuerpos contra el SARS-CoV-2. Este protocolo describe un ensayo de alto rendimiento para detectar anticuerpos anti-SARS-CoV-2 en muestras de suero de pacientes, lo cual es crítico dada la pandemia actual. La mayoría de los ensayos serológicos actuales sacrifican la velocidad por la sensibilidad o viceversa.
Nuestros datos muestran que nuestro ensayo es sensible y tiene un tiempo de respuesta rápido. Para producir una cantidad suficiente de bioreportaje hiBiT-RBD alto, comience por prepararse para el cultivo celular. Primero, prepare el medio de águila modificado completo de Dulbecco que contenga 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina y estreptomicina.
Luego caliente los medios en un baño de agua de 37 grados centígrados. Encienda el gabinete de seguridad biológica y use etanol al 70% para esterilizar la superficie del gabinete. Para cultivar la línea celular, sáquela de menos 80 grados Celsius o nitrógeno líquido y descongele en un baño de agua de 37 grados Celsius.
Mezcle las células descongeladas con al menos 10 mililitros de medio completo. Pipetear la suspensión de la celda en una placa de Petri de 15 centímetros y girar la placa para distribuir las células de manera uniforme. Coloque el plato en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 85 a 95% de humedad.
Observe las células bajo el microscopio hasta que el nivel de confluencia alcance el 80 a 90% En alta confluencia, retire el medio, lave las células con PBS caliente y agregue de tres a cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0.25% para separar las células de la superficie. Después de aproximadamente cinco minutos, observe las células bajo un microscopio. Si todas las células están flotando, agregue al menos cuatro mililitros de medio y transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo estéril.
Cuente las células usando un hemocitómetro y agregue un millón de células en cada pozo de una placa de seis pocillos para la transfección. Para realizar la transfección del plásmido HiBiT-RBD, utilice un microgramo del plásmido de expresión HiBiT-RBD con un reactivo de transfección adecuado. Incubar durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, luego agregar el volumen total a cada pocillo de la placa gota a gota.
Al día siguiente, reemplace el medio que contiene la mezcla de transfección con un medio completo. Observe bien el control de la transfección 48 horas después de la transfección. Recoge el sobrenadante en microtubos de 1,5 mililitros.
Agregue 500 microlitros de tampón de lisis pasiva 1X o PLB a las células, luego incube y agite la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente para la lisis celular. A continuación, para evaluar la señal de luminiscencia del bioreportero utilizando un ensayo de luciferasa, primero prepare los componentes de reacción y use el sobrenadante como fuente del bioreportero. Diluya el BiT grande y el sustrato a 1X antes de usarlo.
Transfiera 50 microlitros del sobrenadante de cada pozo o tubo a una placa de 96 pocillos y agregue 50 microlitros de 1X BiT grande a cada pozo. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Abra el software del luminómetro, agregue 50 microlitros de sustrato 1X a cada pozo, coloque la placa en el luminómetro y ejecute el software.
Para realizar el ensayo de detección de anticuerpos HiBiT-RBD, prepare el bioinformador HiBiT-RBD como se describió anteriormente y combine 50 microlitros del hiBiT-RBD que contienen sobrenadante con un microgramo del anticuerpo comercial SARS-CoV-2 RBD en un microtubo de 1,5 mililitros. Agregue 20 microlitros de proteína de unión a inmunoglobulina o proteína G a la solución. Lleve el volumen total a 300 microlitros agregando PBS.
Incubar los tubos en un agitador o rotador de tubos durante 30 minutos. Centrifugar a 12.000 G durante 30 segundos. Luego deseche el sobrenadante y lávelo con PBS.
Repita el proceso tres veces para eliminar HiBiT-RBD gratis. Resuspend las células en 50 microlitros de PBS y transfiéralo a una placa de 96 pocillos. Agregue 50 microlitros de BiT grande 1X y espere cinco minutos.
Luego agregue 50 microlitros de sustrato 1X NanoLuc. Lea inmediatamente la señal de luminiscencia con un luminómetro. Prepare grandes cantidades del bioreportaje HiBiT-RBD para un ensayo de alto rendimiento y combine 20 microlitros de proteína G magnética con 50 microlitros del sobrenadante HiBiT-RBD en cada pocillo de una placa de 96 pocillos para cada muestra.
Agregue 10 microlitros de la muestra de suero a cada pocillo y lleve el volumen total a 150 microlitros agregando PBS. Incubar durante 30 minutos en un agitador a temperatura ambiente. Luego coloque la placa en una lavadora magnética para precipitar el complejo de anticuerpos de proteína G.
Deseche la solución en la sección central de cada pozo y agregue PBS para lavar. Repita el paso de lavado al menos tres veces para eliminar el exceso de HiBiT-RBD. Agregue 50 microlitros de 1X PBS y 50 microlitros de 1X BiT grande e incube durante al menos cinco minutos a temperatura ambiente.
Prepare el software del luminómetro. Luego agregue 50 microlitros de sustrato 1X. Coloque la placa en la máquina, ejecute el software y registre las señales.
Compare las señales de muestras de suero, muestras de control y señal de fondo de pozos vacíos. Las señales tanto del HiBiT-RBD que contiene lisado celular como del sobrenadante de las células transfectadas se registraron para evaluar la fuente de proteína apropiada. Los datos mostraron un fondo bajo en comparación con una señal fuerte cuando se combinaron ambas partes.
La adición de proteína G ayuda a la precipitación de anticuerpos. El ensayo se utilizó para comparar la señal de un anticuerpo neutralizante comercial del SARS-CoV-2 con una IgG de control. La señal de anticuerpo específica era robusta, mientras que el anticuerpo de control tenía cerca del nivel de fondo luminiscente.
Para vacunar ratones se utilizó el virus de la estomatitis vesicular oncolítica atenuada recombinante o VSV con una mutación en la posición 51 de la proteína M que expresa RBD exógena. El suero recolectado de ratones vacunados produjo una señal robusta en comparación con ninguna señal en ratones inyectados con VSV de control. Este protocolo se puede utilizar para la detección de los anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en muestras de suero de pacientes.
Los pasos de lavado después de la incubación con proteína G son críticos para reducir el fondo. Además, es importante agregar el sustrato lo más rápido posible para evitar la pérdida de señal. Con algunos pasos de optimización adicionales, el mismo ensayo se puede utilizar para analizar muestras de sangre y podría ser un método eficaz para determinar los anticuerpos anti-SARS-CoV-2 en muestras de sangre de pacientes.
