Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы описать процедуры, участвующие в выполнении невоспроизводимого раздавливания седалищного нерва, и предоставить протокол для оценки двигательного поведения после периферической травмы. Выбор мощной и надежной батареи поведенческого теста необходим для охвата широкого спектра поведенческих аспектов и зависит от используемой модели животного и вопроса научных исследований. Этот протокол подробно описывает, как выполнить повреждение седалищного нерва и предоставляет поведенческую тестовую батарею для оценки двигательного дефицита у крыс, которая включает в себя тест в открытом поле, анализ походки CatWalk, задачу ходьбы по балке и задачу ходьбы по лестнице.
Эксперименты на животных проводились в соответствии с применимыми национальными и институциональными руководящими принципами по уходу за животными и их использованию. Поддерживайте стерильную среду в течение всей хирургической процедуры. Установите хирургический стол с необходимым оборудованием.
Глубоко обезболить крысу в закрытом шкафу изофлураном и побрить обширную область правой задней конечности. Затем поместите крысу в анестезионную маску и продолжите глубокую анестезию изофлураном. Зафиксируйте туловищ и обе задние конечности крысы скотчем.
Поместите обе задние конечности в симметричное и вытянутое положение и поверните каждую лапу плоско на стол для операций. Продезинфицируйте кожу выбритого участка соответствующим антисептиком. Поиск седалищной выемки подвздошной кишки.
Сделайте разрез кожи от седалищной выемки в сторону лапы скальпелем. Если задние конечности зафиксированы и разрез кожи выполнен правильно, то можно увидеть полость в фасциальной плоскости между большой ягодичной мышцей и двуглавой мышцей бедра, напоминающую белую линию. Вставьте в полость закрытые сверхтонкие гемостатические щипцы и распределите щипцы.
Фасциальная плоскость должна открываться, не повреждая мышечную ткань. Поместите втягивающие резинки под мышцы, чтобы разрез кожи был открыт. Осторожно удалите все окружающие ткани и кровеносные сосуды из седалищного нерва, пока нерв не будет полностью обнажен.
Важно не растягивать и не тянуть нерв в течение всей процедуры. Раздавите седалищный нерв незазубренным зажимом с постоянным и быстрым пригодным для использования давлением. Для этого откройте зажим, поместите нерв на нижнюю челюсть зажима и закройте зажим, зафиксировав его в первом положении на 3 х 10 секунд.
После травмы раздавливания осторожно откройте зажим. место раздавливания седалищного нерва выглядит полупрозрачным. Снимите втягивающие резинки.
Закройте разрез фасциальной плоскости рассасывающимся швом. Закройте разрез кожи скобами кожи тела. Двигательную активность, а также поведенческую активность крыс можно проанализировать с помощью теста в открытом поле.
Установка открытого поля, которое должно быть расположено в темной и тихой среде, состоит из автоматизированной системы видеослежения EthoVision XT и арены с устойчивой к царапинам, очищаемой черной поверхностью. Поместите арену и камеру в правильное положение и настройте программное обеспечение EthoVision XT. Осторожно поместите крысу в середину испытательной арены.
Во время записи экспериментатор должен держаться подальше от открытого поля, чтобы не отвлекать крысу. Для анализа данных теста открытого поля перейдите в раздел анализа в левой боковой панели и выберите «Визуализация трека» на вкладке «Результаты». Далее экспортируйте необходимые параметры в XL.В программном обеспечении выберите ряд переменных из разных категорий для анализа данных.
Анализ походки системой CatWalk XT может помочь оценить множество различных параметров, касающихся следов, положения и походки животных моделей. Стеклянная дорожка освещается зеленым светом, а свет, рассеянный следами животных, захватывается высокоскоростной видеокамерой, которая расположена под дорожкой. Сигналы могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения CatWalk XT.
Эксперимент должен проводиться в темных условиях. Начните с настройки системы CatWalk XT. Выберите Экспериментальные настройки.
Поместите камеру в положение и отрегулируйте фокус. Настройте параметры обнаружения. Установите стены коридора системы Подиума и убедитесь, что стены остаются параллельными дорожке.
Определите длину дорожки и откалибруйте дорожку. Затем прикрепим фоновое изображение. Для фонового изображения необходима чистая и пустая дорожка.
Крыса должна пересекать дорожку без каких-либо перерывов. Согласно определенным критериям запуска, для анализа данных требуется три совместимых пробега на крысу. Тренируйте животных в течение как минимум восьми дней, прежде чем начать эксперимент.
Подиум должен выполняться не реже одного раза в неделю, от 6 до 10 запусков, чтобы обеспечить непрерывное выполнение задачи. Для анализа данных оценивайте только совместимые прогоны. Автоматическая классификация отпечатков лап с помощью программного обеспечения CatWalk XT.
Просмотрите этикетки для печати лап вручную. Исправьте этикетки с неправильным отпечатком лап, добавьте этикетки с необнаженными отпечатками лап и удалите все шумы и неправильные этикетки. Числовые результаты отображаются на листе XL, показывая ряд основных параметров.
Для получения более подробной информации о каждом следе классифицируйте носики задних лап. Для этого анализа требуется интерактивный модуль измерения занимаемой площади. Установите маркеры для анализа занимаемой площади вручную.
Проанализируйте каждый отпечаток задней лапы во всех трех совместимых прогонах. Протяните линию от центра первого носящего до центра пятого, чтобы измерить разброс ноского. Протяните линию от центра второго носящего до центра четвертого, чтобы измерить промежуточный разброс.
Протяни линию от центра третьего носка до пятки задней лапы, чтобы измерить длину ручного отпечатка. Просмотрите числовые результаты интерактивных измерений занимаемой площади, отображаемые на отдельном листе. Дефицит походки может быть определен по задаче ходьбы с лучом.
В центре внимания задачи ходьбы по лучу в этой конкретной теме исследования будет анализ координации движений, а не оценка двигательного баланса. Для выполнения задачи ходьбы по лучу необходимы луч, распорка, стол, равномерный фон и видеокамера. Используйте деревянную балку длиной 90 сантиметров, шириной 1,7 сантиметра и высотой 2 сантиметра.
Дрессируйте животных в течение семи дней. Поместите крысу на стартовую платформу балки. Крыса должна пересечь балку три раза без каких-либо перерывов.
Даже если крыса достигает трех совместимых пробежек в течение первых трех запусков, для непрерывного выполнения задач должно быть выполнено не менее 6-10 запусков. Выберите видеоряды из трех совместимых прогонов из записи. Определите начальную и конечную точки выбранных трех совместимых запусков.
Здесь точка начала обмечается черной линией на луче, а размещение первой задней конечности за черной линией определяется как начальная временная точка пробега. Размещение первой задней конечности на платформе в конце балки определяет конечную точку времени. Затем рассчитайте время, необходимое крысе, чтобы пересечь балку.
Подсчитыйте количество шагов и ошибок из трех совместимых прогонов для обеих задних конечностей по отдельности, используя функцию масштабирования и замедленного движения программного обеспечения. Ошибки включают в себя полные скольжения ног и скольжения на полфуты. Полное скольжение стопы определяется как размещение стопы, за которым следует глубокое скольжение, вызывающее потерю контакта пораженной лапы с балкой.
Полускользяние определяется как скольжение лапы с боковины балки без потери полного контакта. Рассчитайте процент скольжения стопы по отношению к количеству шагов для пересечения луча. Задача ходьбы по лестнице может оценить двигательную функцию, размещение как передних, так и задних конечностей, а также координацию между конечностями.
Для этого поведенческого теста необходимы устройство лестничной ступени, распорка, стол, однородный фон и видеокамера. Горизонтальный буквенный аппарат состоит из металлических ступеней и прозрачных поликарбонатных боковин. Дрессируйте животных в течение восьми дней.
Поместите крысу в стартовую зону операторов лестничной ступени. Крыса должна пересечь 100-сантиметровую дорожку лестницы трех раз без перерыва, чтобы она квалифицировалась как совместимый бег. Выберите видеоряды из трех совместимых прогонов из записи.
Определите начальную и конечную точки выбранных трех совместимых запусков. Размещение задней конечности за первой черной линией на боковине аппарата определяет начальную временную точку пробега. Размещение первой передней конечности за второй черной линией на боковине аппарата определяет конечную точку времени пробега.
Далее рассчитайте продолжительность пробега по дорожке. Оцените три совместимых пробега по шкале 7 категорий от Метса и его коллег с помощью замедленного движения или покадровой функции программного обеспечения. Определите количество шагов и количество ошибок в соответствии с категориями шкалы для каждой конечности отдельно.
Шкала различает следующие категории. Полный промах. Глубокое скольжение.
Легкое скольжение. Замена.Исправление. Частичное размещение. И правильное размещение.
Затем рассчитайте ошибки на шаг. Репрезентативные результаты пятиминутного теста в открытом поле показывают, что повреждение нерва через пять недель после операции не влияет на двигательную активность. Анализ походки с помощью системы CatWalk XT генерирует множество различных параметров.
Значительные изменения могут быть обнаружены для средней скорости бега, длины шага и области печати поврежденной нервом правой задней лапы. Крысы дикого типа с повреждением нервов показали значительно увеличенное время латентности для пересечения луча по сравнению с наивными крысами дикого типа через пять недель после травмы. В качестве дополнительного считывания задачи ходьбы по балке были подсчитаны полные скольжения и полускользящие повреждения нервом задней конечности и рассмотрены как ошибка для статистического анализа.
Процент ошибок на шаг поврежденной нервом правой задней конечности был значительно увеличен у крыс дикого типа с повреждением нервов по сравнению с наивными крысами дикого типа. Репрезентативные данные задачи ходьбы по лестничной ступени не показывают существенных изменений во времени задержки при пересечении дорожки лестницы ступеньного аппарата или в проценте ошибок на шаг поврежденной нервом правой задней конечности. При анализе процента ошибок на шаг травмированной нервом задней конечности учитывался только балл от 0 до 2 по шкале 7 категорий от Метса и его коллег.
После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как выполнить травму седалищного нерва, и как реализовать многофакторную оценку двигательного поведения у крыс после одностороннего раздавливания седалищного нерва. Для достижения последовательных, воспроизводимых и сопоставимых результатов после повреждения седалищного нерва необходим стандартизированный метод индуцирования нервного раздавливания, а также стандартизированная фенотипическая характеристика. Правильная подготовка к конкретному тесту поведения обеспечивает преимущества экономии времени во время оценки эксперимента и получения лучших результатов.
