Este protocolo es importante porque proporciona el procedimiento completo para crear gotas desde la película lipídica hasta la solución lipídica, las microburbujas y luego las gotas. La principal ventaja de esta técnica es la simplicidad para condensar microburbujas en gotas. Con solo enfriar y arremolinar, se pueden hacer gotas sin necesidad de presurización.
Una demostración visual es crítica porque una prueba simple para ver si las microburbujas se han condensado con éxito es verificando visualmente el cambio en la translucidez. Demostrando el procedimiento estará Kimoon Yoo, un estudiante de maestría en el laboratorio gang Zheng. Usando un decapador, retire el sello de aluminio en el vial de suero y transfiera un mililitro de la solución lipídica a un vial de muestra de vidrio de borosilicato de 1,85 mililitros con una tapa de rosca de fenol dejando que la solución lipídica fluya por la pared interior sin crear burbujas.
Con el vial de muestra de 1,85 mililitros, prepárese para que fluya el gas decafluorobutano en el espacio de cabeza del vial de muestra utilizando el intercambiador de gases. Asegúrese de que todas las válvulas del intercambiador de gases estén correctamente cerradas y que la bomba esté apagada. Abra la válvula del colector y desenfunde cuidadosamente la aguja correspondiente del colector.
Abra la válvula de presión A y la válvula de presión B y gire la válvula del cilindro de gas aproximadamente de 1/16 a 1/8 en sentido contrario a las agujas del reloj para abrirla parcialmente. Abra la válvula de mango en T y desencabierta el vial de muestra con la solución lipídica. Coloque la aguja del colector sobre la interfaz de aire líquido del vial, gire lentamente la válvula reguladora de aire en el sentido de las agujas del reloj hasta que la aguja del medidor del regulador de aire se mueva ligeramente de su posición de reposo y deje que el gas perfluorocarbono fluya suavemente hacia el espacio de cabeza del vial durante 30 segundos, teniendo cuidado de no crear burbujas.
Ajuste la válvula reguladora de aire si es necesario. Después de 30 segundos, mantenga cuidadosa y rápidamente el vial de muestra sin mover demasiado el vial. Tanto la válvula del cilindro de gas, la válvula de mango en T, la válvula del regulador de aire, la válvula de presión A, la válvula de presión B y la válvula del colector.
Encinte cuidadosamente la aguja, luego etiquete el vial de muestra y selle el cuello con una película de cera en el sentido de las agujas del reloj. Guarde el vial de muestra en la oscuridad y a cuatro grados centígrados durante al menos 10 minutos o hasta 24 horas. Coloque aproximadamente 100 gramos de hielo seco en un recipiente aislado en el lugar de hielo regular en otro recipiente aislado.
Recupere un vial de suero de decafluorobutano previamente preparado a agujas de calibre 20 de 1.5 pulgadas, una jeringa de plástico de un mililitro, un recipiente de 200 mililitros, pinzas de metal y un termómetro. Coloque el vial de muestra con la solución lipídica en el agitador mecánico y agite durante 45 segundos. Debería haber un cambio en el color y la translucidez.
Después de la agitación mecánica, colóquelo el vial de muestra del lado derecho hacia arriba protegido de la luz e inicie una cuenta regresiva de 15 minutos para enfriar el vial y seleccionar el tamaño de las microburbujas. Cuando la cuenta regresiva haya alcanzado los 10 minutos, llene un recipiente con aproximadamente 200 mililitros de isopropanol y enfríelo a menos 20 grados centígrados con hielo seco usando pinzas de metal. Después de seleccionar el tamaño de las microburbujas durante 15 minutos, busque la partición de tamaño seleccionada dentro del vial de muestra.
Manteniendo el vial de muestra del lado derecho hacia arriba, desencaja cuidadosamente el vial de muestra y retire aproximadamente 0,7 mililitros de la partición inferior con una aguja calibre 20 de 1,5 pulgadas unida a una jeringa de plástico de un mililitro. Asegúrese de que no se retire ninguna de las particiones superiores y no mueva la jeringa para eliminar las bolsas de aire. Apuntando al círculo central en el tapón de goma, inserte una aguja de calibre 20 diferente en un vial de suero de decafluorobutano mientras mantiene la aguja cerca de la parte superior del vial de suero para ventilar y luego inserte la aguja con microburbujas del tamaño seleccionado.
Transfiera lentamente el tamaño de las microburbujas seleccionadas. Deje que el líquido se deslice suavemente por la pared interior del vial de suero de decafluorobutano. Una vez que se haya transferido toda la solución de microburbujeo seleccionada del tamaño, retire la aguja con la jeringa, pero mantenga la aguja de ventilación para aliviar la presión negativa.
Agregue pequeñas cantidades de hielo seco o isopropanol a temperatura ambiente al baño de isopropanol para asegurarse de que la temperatura del baño esté entre menos 15 y menos 17 grados centígrados. Con la aguja de ventilación de calibre 20 insertada cerca de la parte superior del vial de suero, coloque el vial de suero y el baño de isopropanol, manteniendo el nivel de microburbujas por debajo del nivel del isopropanol, pero el cuello del vial por encima de él y gire intermitentemente el vial de suero durante dos minutos para condensar las microburbujas. No gire el vial de suero continuamente en el isopropanol y no deje que la solución se congele.
Gire durante unos cinco segundos y levante el vial de suero fuera del isopropanol. Verifique si hay nucleación de hielo, luego reanude el remolino en isopropanol. Si hay formación de hielo, gire el vial de suero en el aire hasta que se disipe.
Después de los dos minutos de condensación, retire el vial de suero del baño de isopropanol y retire la aguja de ventilación. Las microburbujas deben haberse condensado en gotas como lo indica el cambio en la translucidez. Limpie el vial de suero, etiquételo y colóquelo sobre hielo regular en un recipiente con aislamiento oscuro hasta que esté listo para su uso.
Las gotas sin abrir con un sello de aluminio intacto deben ser estables hasta por seis horas, siempre y cuando el hielo derretido se reemplace según sea necesario. Cuando esté listo para usar, retire el sello de aluminio con el decapper. Después de usar este protocolo, las microburbujas precondensadas, seleccionadas de tamaño y las gotas postcondensadas se dimensionaron en un contador Coulter con una apertura de 10 micras.
Se muestran los datos de dimensionamiento para la formulación de pirolipídicos al 30%. Las estadísticas basadas en los datos de tamaño se muestran aquí. Utilizando una proporción de diámetros medios pre y postcondensados, los resultados mostraron que a medida que aumentaba el contenido de pirolipídicos, la concentración disminuía y el diámetro medio aumentaba.
Se muestran las mediciones absorbentes representativas de la muestra de gotas de pirolipídicos al 30%. Esto mostró que los ensamblajes intactos tienen diferentes propiedades ópticas reflejadas por diferentes picos en comparación con los componentes lipídicos individuales no ensamblados. Aquí se muestran mediciones de florescencia representativas de la muestra de microburbuja precondensada, gota postcondensada con 30% de pirolípido, que demuestran diferentes picos de fluorescencia para muestras intactas en la forma interrumpida.
Se muestran imágenes de ultrasonido representativas de la muestra de gotas de pirolipídico al 30% fotografiadas a diferentes presiones. A bajas presiones, solo se observó señal de fondo de burbujas de aire pegadas de la síntesis de agar. A una potencia ligeramente mayor, se generaron algunas microburbujas, lo que se demuestra por la aparición de manchas brillantes.
Se generaron más microburbujas a medida que aumentaba la presión. Es importante recordar que la temperatura de condensación aquí está optimizada para esta formulación específica de la cubierta de gotas. Diferentes formulaciones de cáscara pueden requerir una temperatura diferente.
