Este protocolo es un método fácil de reducir la polidispersidad de gotas vaporizables de bajo punto de ebullición para su uso en aplicaciones biomédicas. Esta técnica condensa microburbujas de gas preformadas y filtra las gotas líquidas resultantes por tamaño de una manera que es controlable, escalable y relativamente rentable. Este método se puede aplicar a una variedad de microburbujas lipídicas con diferentes carcasas y materiales de gas utilizando diferentes filtros para controlar el tamaño final de la gota.
Demostrando el procedimiento estará Darrah Merillat, una investigadora de pregrado del laboratorio del Dr. Sirsi. Encienda el interruptor de encendido del sonicador y ajuste la amplitud al máximo permitido utilizando el accesorio de micropunta, y asegure el tiempo de sonicación establecido en 10 segundos. Coloque la solución lipídica hidratada caliente en el recinto de sonido con la micropunta justo debajo de la superficie.
Conecte una longitud adecuada de tubo al cuello del vial para guiar el gas desde la salida del tanque DFB hacia la solución lipídica tibia que se encuentra en el recinto. Abra la válvula del tanque lentamente hasta que se pueda ver que el gas fluye sobre la solución lipídica, causando ligeras ondulaciones en la superficie del líquido. Si el flujo de gas es demasiado alto, la solución se desbordará durante la formación de microburbujas.
Inicie el sonicador y ejecútelo durante 10 segundos continuamente para generar microburbujas. Una vez finalizada la sonicación, cierre inmediatamente la válvula del tanque DFB. Cubra rápidamente la solución de microburbuja y sumerja el vial en un baño de hielo para enfriar la muestra por debajo de 55 grados centígrados.
Use un filtro cerámico de 200 nanómetros para ensamblar la extrusora de alta presión de acuerdo con el manual del usuario, y colóquela en el centro de un recipiente estanco, de modo que el tubo de salida de la muestra no se presione contra el costado ni se engarce. Acople la extrusora al tanque de gas nitrógeno utilizando el adaptador suministrado por el fabricante. Coloque el extremo del tubo de salida en un vial de centelleo para recoger la muestra extruida, asegurando el tubo al recipiente con cinta adhesiva para que permanezca dentro del vial.
Abra y cierre la válvula de liberación para asegurarse de que no haya presión dentro del extrusor. Retire la tapa de la cámara. Y agregue cinco mililitros de PBS a la cámara del extrusor.
Reemplace la tapa, asegurándose de que vuelva a su lugar de forma segura. Abra el tanque de gas nitrógeno, de modo que el manómetro lea 250 PSI, asegurándose de que la válvula de control de presión esté en la posición cerrada. Cierre el tanque de gas y abra la válvula de entrada de la cámara del extrusor, lo que hace que la solución de PBS se empuje a través del sistema y salga del tubo de salida de la muestra hacia el vial de centelleo.
Cuando solo salga gas del tubo, abra la válvula de liberación y permita que la presión caiga a cero PSI. A continuación, retire el vial de centelleo. Abra y cierre la válvula de liberación para asegurarse de que no haya presión dentro de la extrusora y coloque un nuevo vial de centelleo al final del tubo de salida.
Llene un recipiente de acero con 2-metilbutano y agregue hielo seco para bajar la temperatura a menos 18 grados centígrados. Inserte la solución de microburbujas en el 2-metilbutano refrigerado, sumergiendo la muestra durante dos minutos. Mueva el vial de centelleo durante los dos minutos para mezclar suavemente las burbujas.
Agregue hielo seco según sea necesario para mantener la temperatura entre menos 15 y menos 18 grados centígrados. Después de dos minutos, retire las microburbujas del 2-metilbutano refrigerado. Agite suavemente el vial para mezclar las microburbujas y transfiera las burbujas a una jeringa refrigerada de 10 mililitros.
Retire la tapa de la cámara del extrusor y agregue la solución de microburbujas a la cámara empujando lentamente el émbolo sobre la jeringa. Reemplace la tapa de la extrusora, asegurándose de que haga clic de forma segura en su lugar. Verifique que la válvula de control de presión y la válvula de liberación del extrusor estén en la posición cerrada.
Abra el tanque de gas nitrógeno hasta que el manómetro lea 250 PSI. Cierre el tanque de gasolina y gire la válvula de control de presión a la posición abierta. Cuando la solución haya llenado el vial de centelleo en el tubo de salida y solo salga gas del tubo, abra lentamente la válvula de liberación de presión y permita que la presión caiga a cero PSI.
Transfiera 10 mililitros de la solución de gotas extruidas a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar la muestra extruida a 1.500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y las gotas vaporizadas espontáneamente que aparecen en la parte superior de la solución.
Vuelva a suspender el pellet que comprende nanogotas DFP en 10 mililitros de PBS con 20% de glicerol y 20% de propilenglicol. La distribución de tamaño de las soluciones de burbujas condensadas con y sin extrusión muestra que la única muestra condensada tiene una distribución mucho más amplia centrada cerca de 400 nanómetros, mientras que la muestra extruida tiene una distribución más estrecha centrada en 200 nanómetros. El análisis de detección de pulso de resistencia sintonizable utilizado para analizar las gotas de cambio de fase a medida que se han lavado por centrifugación para eliminar el exceso de liposomas muestra que los tamaños de las gotas están cerca de los 200 nanómetros.
Los datos de microscopía de la vaporización de nanogotas cuando se calientan muestran que algunas microburbujas vaporizadas espontáneamente son evidentes en el campo de visión antes del calentamiento, y se observa un mayor número de microburbujas de gas después del calentamiento. Las imágenes de microscopía de nanogotas insertadas en el extrusor directamente sin preenfriamiento, condensadas a cero grados Celsius y a menos 18 grados Celsius se muestran aquí. Las imágenes representativas de gotas condensadas de octafluoropropano antes y después de la vaporización también muestran un mayor número de microburbujas de gas después del calentamiento, similar a las gotas de DFB.
Lo más importante a recordar durante este procedimiento es que el rendimiento de las gotas depende en gran medida de la temperatura y la presión durante la condensación, y las ligeras variaciones afectarán los resultados. Después de generar gotas vaporizables, se pueden utilizar para optimizar las imágenes in vivo y la administración de fármacos mediante ultrasonido, así como otras aplicaciones in vivo y ex vivo. Después de desarrollar esta técnica, se han explorado los efectos del tamaño de las nanogotas y el contenido del núcleo de gas en los umbrales de vaporización in vivo utilizando ligeras modificaciones a este protocolo.
