Este protocolo describe el sistema de dimerización química para inducir condensados de proteínas en los telómeros. Se puede adaptar fácilmente para inducir condensados en otros loci genómicos, y es adecuado para sondear la formación y función de condensados asociados a la cromatina. Este método ofrece la resolución temporal requerida para la obtención de imágenes de células vivas y mantiene la separación de fases en la población de células para ensayos bioquímicos.
Para comenzar, disuelva los dimerizadores en DMSO a 10 milimolares y guárdelos en tubos de microcentrífuga de plástico a menos 80 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo. Diluya una alícuota de dimerizador milimolar de 10 en un medio de imagen a una concentración de stock de 10 micromolares y guárdelo a menos 20 grados centígrados. Cuando esté listo para usar, diluya los diluyers a una concentración de trabajo final de 100 nanomolares en medio de crecimiento o medio de imagen.
Sece de 10 a la quinta celda en vidrios de cubierta circular de 12 milímetros de diámetro recubiertos con Poly-D-Lysine en una placa de seis pozos. Luego transfecta las células con los plásmidos mutantes Halo-GFP-TRF1 y mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDFR-SIM y espere de 24 a 48 horas antes de proceder a la inmunofluorescencia. Agregue los diluidos de 100 diluydores nanomolares a las células e incube en 37 grados Celsius durante cuatro a cinco horas.
Después de la incubación, fije las células en una solución de PBS que contenga 4% de formaldehído y 0.1% de Tritón X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar las células. Luego lave las células tres veces con PBS. La cubierta de lavado se desliza dos veces con 50 microlitros de TBS-Tx y una vez con 50 microlitros de tampón de dilución de anticuerpos.
Incubar cada resbalón de cubierta con 50 microlitros de anticuerpos primarios anti-PML, anti-SUMO-1 o anti-SUMO-2 y 3 a cuatro grados centígrados en una cámara humidificada durante la noche. La cubierta de lavado se desliza tres veces con tampón de dilución de anticuerpos para eliminar el anticuerpo primario no unido, luego incuba las células con anticuerpo secundario durante una hora en una caja oscura a temperatura ambiente. Después de manchar, lave los resbalones de la cubierta tres veces con TBS-Tx.
Etiquete las diapositivas agregando dos microlitros de un microgramo por mililitro DAPI, luego voltee los deslizamientos de la cubierta y colóquelos en la gota de DAPI. Aspire el líquido adicional desde el borde del deslizamiento de la cubierta. Selle la diapositiva con esmalte de uñas, deje que se seque y enjuague la parte superior del resbalón de la cubierta con agua.
Coloque los portaobjetos en el congelador hasta obtener la imagen. Sece de 10 a la quinta célula en vasos de cubierta circular de 12 milímetros recubiertos con Poli-D-lisina en una placa de seis pomos y transfectarlos con halo-TRF1 y plásmidos mutantes mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDHFR-SIM. Fije las células con 4% de formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente y lávelas cuatro veces con PBS.
Para IF-FISH, mante las células con anticuerpos primarios y secundarios y vuelva a fijarlas con 4% de formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego lávelas cuatro veces con PBS y deshidrate los resbalones de la cubierta en una serie de etanol. Incubar los resbalones de la cubierta con la sonda C-PNA de telómeros 488 en cinco microlitros de solución de hibridación a 75 grados centígrados durante cinco minutos, luego incubar los deslizamientos de la cubierta durante la noche en una cámara humidificada a temperatura ambiente. Lave los resbalones de la cubierta tres veces con tampón de lavado durante dos minutos por lavado a temperatura ambiente y móntelos con un microgramo por mililitro DAPI en medios de montaje para imágenes.
Para imágenes en vivo, monte los resbalones de la cubierta en cámaras magnéticas en un escenario calentado en una cámara ambiental, manteniendo las células en un mililitro de medio de imagen sin rojo fenol. Configure el microscopio y el aparato de control ambiental como se describe en el manuscrito de texto. Localice las células con una señal GFP brillante en los telómeros y una señal mCherry difusivo en el citosol.
Encuentre alrededor de 20 celdas, memorizando cada posición con la información XYZ y configure parámetros para imágenes de lapso de tiempo. Utilice un espaciado de 0,5 micrómetros para un total de ocho micrómetros en Z y un intervalo de tiempo de cinco minutos durante dos a cuatro horas para los canales GFP y mCherry. Utilice el 30% de la intensidad de potencia de 594 nanómetros y el 50% de 488 nanómetros, con tiempos de exposición de 200 milisegundos y una ganancia de cámara de 300.
Comience a tomar imágenes y tome un bucle de tiempo como pre-dimerización. Luego detenga las imágenes, agregue 0.5 mililitros de medios de imágenes que contengan 15 microlitros de dimerizador micromolar a la cámara de imágenes, teniendo cuidado de no tocar el escenario y reanude las imágenes. Cuando esté listo para revertir la dimerización, detenga las imágenes y agregue 0,5 mililitros de medios de imagen que contengan dos microlitros de TMP de 100 milimolares a la cámara de imágenes.
Continúe tomando imágenes de las células durante una o dos horas. Para imágenes fijas, use la misma configuración de microscopio que las imágenes en vivo, pero sin el calentamiento de la etapa. Localice alrededor de 30 a 50 células con la señal roja para seleccionar las células transfectadas.
Adquiera imágenes con un espaciado de 0,3 micrómetros para un total de ocho micrómetros en Z.Utilice el 80% de 647 nanómetros, el 80% de 561 nanómetros y el 70% de la intensidad de potencia de 488 nanómetros, con tiempos de exposición de 600 milisegundos y una ganancia de cámara de 300. La localización telomérica de SUMO se identificó utilizando adn telómero FISH e inmunofluorescencia de proteínas SUMO. Las células con reclutamiento DE SIM enriquecieron SUMO-1 y SUMO-2 y 3 en comparación con las células con reclutamiento de mutantes SIM, lo que indica que el enriquecimiento de SUMO inducido por dimerización de SIM en telómeros depende de las interacciones SUMO-SIM.
Aquí se muestra una película de lapso de tiempo de TRF-1 y SIM después de la dimerización. SIM se reclutó con éxito para telómeros, y los focos SIM y TRF-1 se hicieron más grandes y brillantes, como se predijo para la formación y el crecimiento de gotas líquidas. Además, se observó la fusión de focos de TRF-1, lo que condujo a la agrupación de telómeros, como se muestra en la reducción del número de telómeros y el aumento de la intensidad de los telómeros con el tiempo.
Por el contrario, el mutante SIM fue reclutado para telómeros después de la dimerización, pero no indujo ninguna formación de gotas o agrupamiento de telómeros, lo que indica que la separación de fases y la agrupación de telómeros es impulsada por las interacciones SUMO-SIM. Se observó la inversión de la separación de fases y la agrupación de telómeros después de agregar un exceso de TMP libre. El número de telómeros aumentó y la intensidad de los telómeros disminuyó con el tiempo.
Aquí se muestran imágenes representativas de AB identificados por el ADN telómero FISH y la proteína PML IF. Las células con SIM reclutadas tienen más AB que las células con mutante SIM reclutado, lo que sugiere que los condensados inducidos por la dimerización son de hecho AB. Al realizar este protocolo, no exponga los dimerizadores sensibles a la luz a la luz.
Trabaje en una habitación oscura con una lámpara que emite luz roja y envuelva las celdas con papel de aluminio durante la incubación. Siguiendo este procedimiento, el etiquetado de proximidad se puede utilizar para generar una lista completa de componentes en el condensado inducido. Las imágenes en vivo se pueden utilizar para seguir la dinámica de los componentes en el condensado.
Estos métodos pueden ayudar a determinar las funciones de gobernar el control de la composición del condensado.
