Los organoides tumorales derivados del paciente recapitulan la arquitectura y la función del tejido tumoral con precisión con una mejor reproducibilidad de la enfermedad. Por lo tanto, la respuesta de un paciente a los medicamentos contra el cáncer se puede evaluar con precisión utilizando este modelo. Los organoides tumorales no son adecuados para un sistema de ensayo de alto rendimiento in vitro o análisis celular debido a la formación de grandes grupos en cultivo.
Utilizando esta técnica, se desarrolló HTS simple y más preciso para la evaluación de fármacos moleculares dirigidos. Dado que el cultivo de organoides es muy diferente del cultivo 2D, uno puede sentirse confundido sobre el cultivo al principio, pero es importante observar cuidadosamente los cambios morfológicos de los organoides. Después de eliminar el vil congelado del almacenamiento de nitrógeno líquido, agite suavemente los organoides tumorales derivados del paciente en un baño de agua a 37 grados centígrados durante un minuto.
Retire el vil del baño de agua y limpie con etanol al 70%. Luego coloque el vial en el gabinete de bioseguridad. Transfiera los organoides tumorales en un tubo de 15 mililitros que contenga el medio para los organoides.
Use una pipeta de transferencia de tres mililitros para mezclar suavemente los organoides tumorales y el medio mediante la pipetería hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Peletizar los organoides tumorales por centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo organoide tumoral en cinco mililitros de medio fresco.
Transfiera la suspensión organoide del tumor a un matraz T25 e incube a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de una semana del primer pasaje, transfiera la suspensión organoide tumoral de dos matraces T25 a dos tubos de centrífuga y grica por los organoides tumorales por centrifugación. Estimar el volumen de gránulos organoides tumorales y resuspendir el gránulo en 2,5 mililitros de medio fresco por tubo.
Agrupe la suspensión organoide del tumor en un tubo. Transfiera la suspensión agrupada a un matraz T75 que contenga 10 mililitros de medio fresco e incube a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas de cambio de medio, picar los organoides tumorales utilizando un instrumento de fragmentación y dispersión celular equipado con un soporte de filtro que contiene un filtro de malla de 70 micrómetros.
Diluir 15 mililitros de suspensión organoide tumoral 10 veces. Use el dispensador de suspensión celular para sembrar 40 microlitros de suspensión de organoides tumorales diluidos en una microplaca de esferoides de unión ultra baja de 384 pocillos. Después de 24 horas, use un manipulador de líquidos para agregar 0.04 microlitros de soluciones de agentes de prueba de 10 diluciones en serie en rangos de concentración final de 20 micromolares a 1.0 nanomolares en los pozos, e incube la placa durante seis días.
Al final de la incubación, agregue un reactivo de medición de ATP intracelular en los pozos de prueba. Use un mezclador para mezclar el contenido de la placa e incubar la placa durante 10 minutos a aproximadamente 25 grados centígrados. Utilice un lector de placas para medir el contenido intracelular de ATP como luminiscencia.
Después de 24 horas del tercer pasaje, coloque una microplaca esferoide de fijación ultra baja de 384 pocillos con 40 microlitros de medio por pozo como una placa de destino en el sistema de selección e imágenes celulares. Construya la cámara de recolección con seis mililitros de medio de cultivo y centrífuga a 1, 500 veces G durante dos minutos para eliminar las burbujas de aire. Agregue cuatro microlitros de suspensión de organoides tumorales en la cámara de recolección y coloque la cámara de recolección en el sistema.
Permita que los grupos de células se asienten en la parte inferior de la cámara durante un minuto después de la dispersión y luego inicie el escaneo de la cámara. Establezca el tamaño de recolección en 140 a 160 micrómetros en el sistema para la selección automática de grupos de células. A continuación, verifique la calidad de los grupos de células seleccionados en las imágenes escaneadas y transfiera 10 grupos de células por pozo utilizando puntas de selección en la placa de destino.
En el estudio actual, se evaluó el efecto de los agentes anticancerígenos sobre el organoide tumoral derivado del paciente. La alta sensibilidad para todos los agentes anticancerígenos fue indicada por los valores de concentración inhibitoria medio máximos inferiores a dos micromolares en el área bajo los valores de la curva inferiores a 282. Para una evaluación de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, se midió el porcentaje de citólisis de organoides tumorales en presencia de dos anticuerpos diferentes.
El porcentaje de citólisis aumentó con el tiempo. Sin los anticuerpos a las seis horas con la relación efector-célula diana de uno a uno, la citólisis alcanzó el 45%Mientras que en la proporción de dos a uno, la citólisis alcanzó el 70%La citólisis mediada por células asesinas naturales con trastuzumab fue de aproximadamente el 60% en la relación efector-célula diana de uno a uno, y el 80% en la proporción de dos a uno a las seis horas. En contraste, cetuximab tuvo un impacto dependiente de la dosis en la citólisis mediada por células asesinas naturales.
A la concentración más alta de cetuximab, se observó un 90% de citólisis en la relación efectora-célula diana de uno a uno, y se observó un 100% de citólisis en la proporción de dos a uno, lo que indica una alta efectividad de cetuximab. Un sistema de ensayo de alto rendimiento que utiliza organoides tumorales derivados del paciente es superior a la evaluación de posibles agentes anticancerígenos y presenta oportunidades para la evaluación de medicamentos y avances en la medicina personalizada.
