Los organoides derivados de pacientes humanos son sistemas modelo tridimensionales in vitro que representan tanto la diversidad del paciente como la heterogeneidad celular de los tumores. Este protocolo y demostración en video proporcionan una guía detallada y práctica para establecer el tumor de mama derivado del paciente y los organoides normales. Los organoides de tumores de mama derivados de pacientes son nuevos modelos emocionantes, pero difíciles de establecer.
El protocolo integral que proporcionamos aquí debería ayudar a preparar a los investigadores que intentan desarrollar organoides mamarios y familiarizarlos con los desafíos esperados. Cada línea PDO derivada de un paciente diferente es única en morfología y tasa de crecimiento. A diferencia de dos sistemas de líneas celulares 2D, los organoides crecen mejor cuando se colocan en una alta densidad, lo que permite mejores interacciones intercelulares.
Demostrando el procedimiento estará Disha Aggarwal, una estudiante graduada en mi laboratorio. Para comenzar, descongele una botella de matriz de membrana basal en hielo o durante la noche a cuatro grados centígrados. Transfiera el tejido resecado a una placa de Petri estéril de 10 centímetros.
Examine el tejido macroscópicamente y tome nota si parece morfológicamente graso, vascularizado o necrótico. Además, registre el tamaño y la forma del tejido y tome una imagen del tejido con una regla a la vista. Picar el tejido en trozos pequeños con un bisturí estéril número 10 y transferirlo a un tubo cónico de 50 mililitros.
Agregue 10 mililitros de dos miligramos por mililitro de solución de colagenasa IV y selle el tubo. Coloque el tubo en un agitador orbital a 37 grados centígrados a 140 RPM durante 30 a 90 minutos en un ángulo de 30 grados. Durante la incubación, coloque una alícuota de medio completo a precalentar a 37 grados centígrados en una cuenta o baño de agua.
Cada 15 minutos, resuspender el tejido mezclando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica prerecubierta estéril de cinco mililitros. Monitoreó la disociación a lo largo del tiempo observando el tubo bajo el microscopio con un aumento de 5X o más. Una vez que el tejido esté disociado, centrifugar a 400 G durante cinco minutos, aspirar el sobrenadante y agregar 10 mililitros de AdDF + Nuevamente, centrifugar y aspirar cuidadosamente el sobrenadante, ya que los gránulos de tejido ocasionalmente pueden estar sueltos.
Si el pellet de tejido está parcialmente rojo, agregue dos mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, agregue 10 mililitros de AdDF + al tubo, centrifugar a 400 G durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 50 a 300 microlitros de matriz de membrana basal fría sin diluir y mezclar pipeteando cuidadosamente para evitar la formación de burbujas.
Usando una placa de cultivo de tejido de seis pocillos que se precalienta en la incubadora durante la noche, coloque 300 microlitros de cúpula de matriz de membrana basal que contenga organoides en cada pozo. Deje la placa sin ser molestada en la campana durante cinco minutos antes de colocarla a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos para que la cúpula de la matriz de la membrana basal se solidifique completamente. Al final de la incubación, agregue tres mililitros de medio completo precalentado gota a gota a cada pozo e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Después de la incubación, capture imágenes de los organoides utilizando un objetivo 5X en un microscopio de campo brillante invertido. Levante la cúpula de la matriz de la membrana basal en el medio en el pozo usando un raspador celular o una punta de pipeta de un mililitro. Usando una punta de pipeta prerecubierta, transfiera la cúpula flotante de los organoides con un tubo cónico mediano a 15 o 50 mililitros, dependiendo del número de pozos que se cosechan.
Luego agregue DPBS para aumentar el volumen a al menos cinco mililitros. Gire los tubos a 400 G durante cinco minutos. La matriz de la membrana basal con organoides forma una capa en la parte inferior.
Después de aspirar el sobrenadante, agregue de 5 a 20 mililitros de DPBS, dependiendo de la cantidad de pocillos agrupados en un tubo. Mezclar el pellet organoide de matriz de membrana basal en DBPS utilizando una pipeta desechable estéril prerecubierta. Nuevamente, centrifugar y desechar el sobrenadante.
Usando una punta de pipeta recubierta, agregue un reactivo de disociación celular a tres veces el volumen de la matriz de la membrana basal y resuspenda los organoides. Coloque el tubo en un agitador orbital a 37 grados centígrados a 140 RPM durante 8 a 15 minutos en una posición en ángulo. Controle el tubo observándolo bajo el microscopio cada cinco minutos para asegurarse de que los organoides se dividan en grupos más pequeños.
Añadir AdDF+ a un volumen igual o superior al reactivo de disociación celular y pipeta para mezclar los organoides. Girar a 400 G durante cinco minutos para obtener una bolita de organoide. Una vez obtenido un pellet de organoide blanco sin matriz de membrana basal no disuelta, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de AdDF+Enrasar el volumen a 10 mililitros con AdDF+Girar el tubo para el paso de lavado y desechar el sobrenadante.
Agregue la cantidad requerida de matriz de membrana basal a los organoides digeridos en función de la proporción de división adecuada. Mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para evitar crear burbujas e inmediatamente colocar sobre hielo. Placa de cúpulas de 300 microlitros de organoides resuspendidas en una matriz de membrana basal en una placa de seis pocillos precalentada.
Deje la placa sin ser molestada en la campana durante cinco minutos antes de colocarla a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 20 a 30 minutos para que las cúpulas se solidifiquen. Al final de la incubación, y tres mililitros de medio completo precalentado a cada pocillo y colocar la placa de nuevo en la incubadora. Agregue un medio completo fresco cada cinco a siete días.
Las diversas líneas organoides de tumores de mama derivados del paciente difieren en morfología y tasa de crecimiento. Los organoides mamarios normales y los pocos carcinomas ductales tempranos en organoides derivados de C2 se parecían a la estructura mamaria normal, con una luz central rodeada de células ductales. Los organoides derivados del carcinoma lobulillar invasivo tienden a formar estructuras similares a racimos de uva poco adheridas.
Mientras tanto, los organoides derivados de carcinomas ductales invasivos tienden a formar organoides densos, grandes y redondos. El crecimiento de los organoides se midió utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente en los días tres, seis, nueve y 12, con una lectura de referencia el primer día después del enchapado. Las imágenes de campo brillante de los mismos organoides expandidos con el tiempo se muestran aquí.
Algunas líneas de organoides derivadas del paciente tienen un tiempo de duplicación de dos días, mientras que otras tardan cinco días. Es importante ser paciente con líneas organoides particulares que son lentas para establecerse. En nuestra experiencia, el aumento de la densidad del revestimiento o el filtrado de residuos promueve el crecimiento de las DOP.
Los organoides derivados del paciente, o PDO, son excelentes modelos para la detección de drogas. Modelan las interacciones célula-célula y matriz célula-extracelular que son clave para estudiar la fisiopatología del cáncer. Además, las PDO pueden someterse a manipulación genética y pueden usarse para desarrollar xenoinjertos en sistemas de cocultivo, lo que los convierte en excelentes modelos para estudios mecanicistas.
