El objetivo de este procedimiento es analizar extractos de plantas por RMN de desplazamiento puro. El siguiente protocolo incluye aspectos clave en la preparación de muestras de diferentes matrices de plantas, hojas de vainilla, tubérculos de papa y frutos de uchuva, y el procedimiento detallado de RMN paso a paso para registrar los espectros óptimos de pura mutación y zafiro. El perfil metabólico por RMN de protones es el arte de analizar señal por señal en la miríada de señales dentro de los espectros de RMN de una mezcla biológica compleja con el objetivo de identificar cada metabolito en esta mezcla.
El objetivo es describir biomarcadores que podrían estar asociados con la quimiotaxonimia, el fenotipado, las propiedades organolépticas, la denominación de origen, las respuestas metabólicas, entre otras áreas importantes en las ciencias de las plantas. La RMN de protones se usa comúnmente en la elaboración de perfiles metabólicos. Sin embargo, el gran número de señales con multiplicidades expandidas confinadas en un estrecho rango espectral de productos conduce a una gran superposición, lo que complica el análisis y la interpretación del espectro.
Por lo general, una sola resonancia tiene un ancho que oscila entre uno y cinco hercios. Sin embargo, una señal altamente acoplada puede propagarse en más de 25 o incluso 50 hercios, lo que aumenta la probabilidad de superposición de señales. Para superar esta limitación, aplicamos el método moderno de RMN de desplazamiento puro para anunciar la resolución espectral como se muestra aquí en tres escenarios de plantas diferentes.
La preparación de la muestra, la preparación del extracto de la planta se puede realizar de muchas maneras y el procedimiento dependerá de la matriz. Primero se homogeneizaron los frutos de la uchuva en un jugo. Las hojas de vainilla se utilizaron intactas y las patatas se cortaron en rodajas protegidas de la oxidación.
En todos los casos, el material fue liofilizado, molido y luego extraído. Para los frutos de uchuva y las patatas, se utilizó agua para la extracción, ayudada por la sonicación. El sobrenadante se recuperaba por centrifugación, cualquier líquido se secaba por liofilización o speed vac.
El extracto seco se resuspendió en tampón de oxalato, se evaporó hasta la sequedad y se volvió a disolver en D2O que contenía TMSP. En el caso de la vainilla, la extracción fue directa utilizando tampón de fosfato deuterado que contenía TMSP y metanol deuterado. El sobrenadante también se recuperó por centrifugación.
Todas las muestras se filtraron a través de un filtro de jeringa de PTFE y los tubos de RMN se llenaron con 0,6 mililitros de la solución filtrada. La preparación de muestras en metabolómica de RMN es clave. Dado que el procedimiento se repetirá tal vez cientos de veces, debe prepararse exactamente de la misma manera, para garantizar que la variación observada no se deba a la preparación de la muestra, sino a diferencias reales entre las plantas estudiadas.
RMN de desplazamiento puro. El espectro de RMN se obtiene después de la transformada de Fourier de la señal FID. La señal FID se puede descomponer en dos componentes, la modulación de desplazamiento químico y la modulación de acoplamiento J responsable del patrón de división del acoplamiento J.
La modulación del acoplamiento J podría ser reenfocada por un elemento de reenfoque de acoplamiento J, que invierte selectivamente los espines pasivos mientras que los espines activos no se ven afectados. Después de dos retardos iguales, el acoplamiento químico J se reenfoca por completo. El elemento Psyche basado en un experimento anti-z-COSY es uno de los elementos de reenfoque de banda ancha más robustos y sensibles, propiedades que lo hacen adecuado para la metabolómica de RMN.
Los experimentos de desplazamiento puro se basan en el reenfoque de la evolución del acoplamiento J durante el registro de desplazamiento químico. Por lo general, esto se logra aumentando los retrasos para mover el punto de reenfoque del acoplamiento J. A medida que el desplazamiento químico evoluciona a una frecuencia más alta que el acoplamiento J, se puede registrar un experimento homonuclear desacoplado en forma de interferograma.
La adquisición de interferograma, consiste en registrar el FID por pequeños trozos con el punto de reenfoque de la evolución del acoplamiento J, siempre coincidiendo con el centro del trozo adquirido. El FID desacoplado se construye concatenando cada fragmento sucesivo. Configuración de adquisición de datos de RMN, transfiera las muestras al espectrómetro de RMN.
Ajuste y haga coincidir la cabeza de la sonda, bloquee y calce la muestra. Calibra el pulso duro de 90 grados. Ejecute un espectro de RMN de protones 1D estándar.
Experimento psique. Seleccione la secuencia de pulso reset psyche 1D de la biblioteca TopSpin de Bruker. Establezca el ancho del espectro en cinco kilohercios.
La recuperación de la relajación se retrasa al menos a uno o dos segundos. El maniquí escanea hasta 16. El número de escaneos a 64 o 128 y el número de puntos de datos complejos por bloque, ya sea 64 o 128, establecen la excitación deseada del ángulo de cambio del pulso de chirp.
Una buena relación entre la sensibilidad y los artefactos de reacoplamiento bajos es establecer la constante de 61 a 20 grados, 10 kilohercios para el ancho de banda del pulso de chirrido. Ajuste la longitud del pulso duro al volumen previamente calibrado y la longitud del pulso de la forma de la psique a 30 milisegundos. Elija el Crp_psyche.
Pulso de 20 formas para el elemento psique. La intensidad del gradiente del campo de pulso aplicado durante el elemento psique normalmente se establece entre el uno y el 4% de la fuerza máxima del gradiente dependiendo de la sonda. Elija RECT.
1 para el pulso de forma degradada. Establezca el número de bloques que se van a adquirir para reconstruir el FID de desplazamiento puro. Por lo general, 16 o 32 bloques con 64 o 128 puntos complejos por bloque proporcionarán suficiente resolución digital, recorrerán el espectro y procesarán los datos.
Con el programa de proc_reset AU de Bruker, y luego la transformada de Fourier. Recomendamos transformar el espectro utilizando el relleno de cero y una apodización de campana sinusoidal. Psyche es un experimento de interferograma pseudo 2D.
Es el software de un artefacto periódico de envergadura lateral que llega de la pequeña evolución del acoplamiento J durante la adquisición de cada bloque que generalmente oscila entre cinco y 20 milisegundos en el análisis de compuesto puro, estos artefactos pueden descuidarse ya que normalmente representan menos del 5% del pico principal. Sin embargo, en mezclas complejas, el artefacto de la envergadura lateral de algún metabolito podría ser tan grande o mayor que la señal de metabolitos menos concentrados, lo que compromete la precisión del análisis metabólico. Estos artefactos se pueden eliminar de manera eficiente utilizando un experimento de modificación de psique llamado SAPPHIRE psyche desarrollado en el experimento de psique SAPPHIRE de Morris Lab.
Para alcanzar el espectro desacoplado, la secuencia de pulsos adquiere pequeños trozos de reenfoque FID en el acoplamiento J en el centro de cada bloque. Sin embargo, se produce una pequeña evolución del acoplamiento J durante cada bloque y genera los artefactos periódicos de la banda lateral. El experimento de la psique SAPPHIRE es una modificación de la secuencia regular de la psique en la que estos artefactos periódicos se eliminan mediante una modulación sistemática de fase, lograda mediante el cambio en el punto de reenfoque J.
Después de agregar cada modulación de fase, la evolución residual del acoplamiento J se suprime en gran medida, lo que produce un espectro de desplazamiento puro mucho más limpio. Seleccione la secuencia de pulsos SAPPHIRE psyche y ajuste los parámetros de la secuencia de pulsos. Esta secuencia no está en el repertorio de Bruker, sin embargo, la secuencia y los programas de procesamiento se pueden obtener del sitio web del grupo de metodología de RMN de Manchester.
Los parámetros estándar se establecen en los siguientes valores, ancho espectral de cinco kilohercios, al menos uno o dos segundos de retardo de relajación. 16 exploraciones ficticias, ocho o 16 exploraciones por incremento y D2 establecido en 14 milisegundos. Este parámetro garantiza que la relajación T2 permanezca constante con cada incremento de modulación J.
Establezca el valor deseado de excitación del ángulo de volteo del pulso de chirp y el ancho de banda del pulso. Establezca la longitud del pulso duro en el valor calibrado previamente y la longitud del pulso en forma de psique en 30 milisegundos. Elige el pulso de forma PSYCHE_Saltire_10kHz_30m para el elemento psique.
Establece la intensidad del gradiente de campo de pulso aplicado durante el elemento psique. Elija RECT. 1 para la forma de degradado.
Establezca el número de incrementos de modulación Sapphire J en F2, normalmente ocho incrementos aseguran una excelente supresión de los artefactos de banda lateral. Establezca las ventanas espectrales F1 y F2 que se calcularon a partir del valor de la ventana espectral F3 seleccionado mediante las siguientes expresiones. La duración del bloque de cambio puro descrita como uno sobre SW1 suele establecerse entre 20 y 40 milisegundos.
Establezca el número de bloques de desplazamiento puro. Dado que SAPPHIRE psyche necesita compensar la modulación de fase de desacoplamiento del primer bloque, es necesario agregar un bloque adicional. Normalmente, 17 o 33 bloques dan suficiente resolución digital.
Procesar los datos, ejecutar en el pm_pshift y el pm_fidadd programas AU seguidos de la transformada de Fourier, recomendamos transformar el espectro utilizando el relleno de cero y asignar apodización de campana. Resultados, los experimentos con SAPPHIRE psyche aumentan la resolución de los espectros al colapsar las resonancias acopladas en singletes agradables y afilados, como se ha demostrado en tres matrices de plantas diferentes. Las hojas de vainilla, las frutas de Physalis Peruviana y los tubérculos de papa con multiplicidades del complejo SAPPHIRE Psyche, por ejemplo, los hidrógenos altamente acoplados del ácido homocítrico que generan señales casi continuas que se expanden a través de 40 hercios colapsados en tres singletes afilados.
Reducir la aglomeración que podría estar enmascarando otras señales en la zona. La ganancia de resolución también facilitó desenredar claramente la región altamente superpuesta entre 2,6 a 2,8 PPM en la que el ácido homocítrico es lactona y aparecen resonancias de ácido málico. Los biomarcadores clave en la vainilla, por ejemplo, cuyas señales se superponen con las de los glucósidos en la RMN de protones regulares, se identificaron mejor en los espectros SAPPHIRE debido a este notable aumento en la resolución. Conclusiones.
Pure shift es una nueva y excelente herramienta para la metabolómica de las plantas. Aumentó drásticamente la resolución del espectro y, por lo tanto, permite una identificación más fácil de los metabolitos, un análisis métrico de correlación más fino y una mejor interpretación del análisis multivariante. Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo preparar diferentes extractos de plan para el análisis de RMN y cómo registrar el espectro óptimo de psique de cambio puro y zafiro.
