Los autores desean agradecer al Dr. Jean-Michel Ané en el Departamento de Agronomía de la Universidad de Wisconsin-Madison para proporcionar muestras de Medicago truncatula. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la Fundación Nacional de Ciencia (NSF) de subvención CHE-0957784, de la Universidad de Wisconsin Escuela de Postgrado y la Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) y el programa Romnes Facultad de Becas de Investigación (para SD). EG reconoce un Graduate Research Fellowship NSF (DGE-1256259).

1. Instrumentación <ol><li> MALDI-TOF/TOF MSI. Utilice un espectrómetro de masas equipados con una fuente MALDI para el análisis de pequeñas moléculas (véase la Tabla de Materiales / Equipos). Lleve a cabo adquisiciones en modo de iones positivos o negativos en función de los analitos de interés. Especificar un intervalo de masa de interés y recoger 500 disparos de láser / lugar en intervalos de 50 micras, tanto en la dimensiones X e Y a través de la superficie de la muestra para generar imágenes de iones. La anchura de trama y el número de disparos de láser se pueden ajustar para obtener una mayor resolución espacial y la intensidad máxima de la señal, respectivamente. Utilice picos de matriz de DHB o normas internas aplicadas a la diapositiva o directamente al tejido para calibrar los espectros de masas. </li><li> Alta Resolución LC-MS. (Véase la Tabla de Materiales / Equipos) extractos de muestras correr con LC-MS usando ya sea en fase inversa (RP) LC con una columna C-18, o fase normal (NP) con una columna HILIC dependiendo de los analitos de interés. Utilice fases móviles ygradientes como apropiadas para el tipo de muestra específica. Realizar adquisiciones en modo de iones positivos o negativos dependiendo del tipo de muestra. </li></ol> 2. Preparación de Tejido <ol><li> Recorte el nódulo de la raíz de la planta, dejando 3-4 mm de raíz unidos al nódulo. </li><li> Inmediatamente después de la disección, el uso de fórceps para colocar el tejido en una taza criostato y cubrir con gelatina (100 mg / ml en agua desionizada). Es esencial para el tejido que se va pegado a la parte inferior de la copa sin burbujas de aire. </li><li> Flash congelar el tejido mediante la colocación de la copa en un baño de hielo seco / etanol hasta que la gelatina se endurece y se vuelve opaca. Almacene las muestras a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Retire muestras del -80 ° C congelador, cortar la copa criostato de plástico y retirar el exceso de gelatina. Monte el tejido embebido al mandril criostato con una cantidad tamaño de una moneda de la temperatura óptima de corte (OCT) medios, aunque no soltar el octubre tocar el tejido. Colocar en criostatoboxear hasta que solidifica octubre. </li><li> Permita que el mandril y la gelatina se equilibren en el cuadro de criostato (ajustado a -20 o -25 ° C) durante aproximadamente 15 min. </li><li> Utilice el criostato (véase la Tabla de Materiales / Equipos) a la sección de tejido de aproximadamente el grosor de una celda (8-20 micras dependiendo del tipo de tejido) y descongelación montar cada rebanada sobre el vidrio revestido con ITO por el calentamiento de la parte posterior (no ITO lado) de un portaobjetos de vidrio recubierto de ITO en la parte posterior de su mano-revestido. Coloque el lado recubierto de ITO de la diapositiva calentado cerca de la lámina de tejido congelado y permita que el segmento se pegue en la diapositiva. La colocación de las secciones juntas en la diapositiva proporcionará una mejor alineación durante el MSI. </li></ol> 3. Aplicación Matrix <ol><li> Aplicación del aerógrafo de Matrix MALDI <ol><li> Todos los procedimientos de aerógrafo se debe realizar en una campana de humos. </li><li> Limpiar a fondo el depósito de solución aerógrafo y la boquilla (véase la Tabla de Materiales / Equipos) con metanol yllenar el envase de la solución con una solución de matriz de DHB (150 mg / ml en 50% methanol/0.1% de TFA v / v). </li><li> Mantenga el aerógrafo aproximadamente 35 cm de la muestra y aplicar 10-15 capas de matriz en la superficie de la corredera con una duración de 10 segundos de pulverización y 30 seg tiempo de secado entre cada capa. </li><li> Limpiar a fondo el aerógrafo de nuevo con metanol cuando haya terminado para evitar la obstrucción de la solución matriz. </li></ol></li><li> Automático Aplicación pulverizador de Matrix MALDI <ol><li> Siga las instrucciones de puesta en marcha proporcionados por los fabricantes del sistema de rociador automático. </li><li> Para MSI de metabolitos en nódulos de las raíces utilizando 40 mg / ml (en el 50% methanol/0.1% TFA v / v) DHB como la matriz, ajustar la temperatura de ~ 80 ° C, la velocidad de 1250 mm / min, velocidad de flujo de 50 l / min, y el número de pasadas a 24. Para una mejor cobertura, se recomienda para rotar la boquilla de 90 ° y / o desplazamiento de la boquilla de 1,5 mm entre cada pasada. Inicie método pulverizador. Como una SIde nota, el sistema pulverizador particular usado aquí se calienta la boquilla para acelerar la evaporación del disolvente. Como el disolvente se evapora, la concentración de la matriz aumenta rápidamente. La matriz aplicada a la muestra con el aerógrafo y el pulverizador automático tiene concentraciones comparables. </li><li> Siga las instrucciones de apagado proporcionadas por los fabricantes del sistema de rociador automático. </li></ol></li><li> Aplicación de la sublimación de la matriz de MALDI <ol><li> Pesar 300 mg de DHB en la parte inferior de la cámara de sublimación (véase la Tabla de Materiales / Equipos). </li><li> Pegar el portaobjetos de vidrio para el dedo frío (parte superior de la cámara de sublimación) con las secciones de tejido hacia abajo con cinta de doble cara, conductora. Cubrir toda la parte de atrás de la corredera con la cinta de doble cara, incluso para conductividad, la producción de incluso la deposición de matriz. </li><li> Fije las mitades superior e inferior de la cámara de la sublimación, junto con el C-clamp. Conecte el vacío y add hielo y agua fría al depósito superior. </li><li> Coloque cámara de sublimación en una manta de calentamiento que está a temperatura ambiente. </li><li> Encienda la bomba de vacío. Espere 15 minutos y encienda la manta calefactora. El manto de calentamiento debe alcanzar 120 º C en el transcurso de 10 min. </li><li> Después de 10 minutos, se apaga el fuego, cierre la válvula de vacío (por lo que el interior de la cámara se mantiene al vacío) y apague la bomba de vacío. </li><li> Deje que la cámara alcance la temperatura ambiente, abra la válvula de liberación de la presión de vacío y retire la muestra. El tamaño de la cámara de sublimación determinará la cantidad de matriz sublimado a la lámina de vidrio. Las cámaras de sublimación más grandes (del tamaño de un vaso de 400 ml) utilizarán aproximadamente 300 mg de DHB mientras que las cámaras más pequeñas (del tamaño de un vaso de 150 ml) utilizarán aproximadamente 100 mg de DHB y requerirán el corte de la lámina de vidrio de forma que encaja en la cámara. </li></ol></li></ol> 4. Adquisición de imágenes <ol> &lt;li&gt; Marcar un patrón + en cada esquina de la muestra con un lápiz corrector líquido WiteOut para ser utilizado como &quot;enseñar a los puntos&quot;. Coloque la placa de vidrio en la placa de adaptador de diapositivas MALDI y tomar una imagen óptica de la muestra utilizando un escáner. </li><li> Crear un archivo de adquisición de imágenes mediante el software proporcionado por el fabricante del aparato, con un tamaño de paso de trama de 50 my un diámetro de láser igual o más pequeño que el tamaño de paso de la trama. En este instrumento en particular, el ajuste mínimo láser da un diámetro de láser de ajuste de láser de aproximadamente 10 micras y pequeño tiene un diámetro de 40-50 micras. </li><li> Cargar la imagen óptica en el software y alinear la placa con la imagen óptica. </li><li> Calibre el instrumento antes de iniciar la adquisición utilizando iones comunes de la matriz de racimo, las normas internas, o una mezcla de calibración. </li><li> Especifique las áreas de tejido para ser analizados con MSI, incluyendo un punto de la matriz pura en la diapositiva para ser utilizado como un &quot;espacio en blanco&quot;. </li><li> Comience acadquisición. </li></ol> 5. Generación de Imagen <ol><li> Abra el archivo de imágenes en el software disponible en el mercado proporcionado por el vendedor y extraer las imágenes de iones. Otro software de código abierto está disponible para el procesamiento de datos MSI 19. </li></ol> 6. Identificación de metabolitos <ol><li> Seleccionar un m / z de interés específico del espectro de masas mediante el software específico del proveedor (véase la Tabla de Materiales / Equipos). Un analito puede ser distinguido de un ión matriz cuando un pico del analito se selecciona entre el espectro de masas de iones y las imágenes se generan localiza específicamente a la sección de tejido. </li><li> Generar una lista de los analitos de interés y llevar a cabo experimentos de MS / MS. Ver Tabla 1 y Tabla 2 en Resultados representante para las listas de muestra de analitos. </li><li> Realizar análisis LC-MS específica en un espectrómetro de masas de alta resolución (o alta resolución MALDI-MS, si está disponible) para obtener información precisamediciones de la masa de los analitos de interés y también realizar LC-MS/MS de los analitos de interés para obtener patrones de fragmentación característicos. </li><li> Realice la búsqueda de base de datos para determinar las identificaciones putativos para los analitos específicos. Ejemplos de bases de datos de metabolitos incluyen: METLIN, Propiedades físicas, PubChem, KEGG, y HMDB. </li><li> Para confirmar las identificaciones putativos de búsqueda de base de datos precisa de masas, que coincida con la MS / MS de los analitos dirigidos a MS / MS espectros de las normas, la literatura, y / o software de predicción de la fragmentación. </li></ol>

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Chem. 84, 2048-2054 (2012).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene:+a+new+matrix+for+the+selective+analysis+of+low+molecular+weight+amines+and+direct+determination+of+creatinine+in+urine+by+MALDI-TOF+MS.">2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).</li><li>Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base-driven+matrix-assisted+mass+spectrometry+for+targeted+metabolomics.">Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Jpn. 55, 145-148 (2007).</li><li>Paschke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirion-A+Software+Package+for+Automatic+Processing+of+Mass+Spectrometric+Images.">Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).</li><li>Parry, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=omniSpect:+an+open+MATLAB-based+tool+for+visualization+and+analysis+of+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+and+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+images.">omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Como se comentó anteriormente, la preparación de la muestra es el paso más crítico en el flujo de trabajo de MSI. Incorporación de los tejidos de manera desigual hará que el corte a ser difícil o imposible en algunos casos. El tamaño de la sección y el tiempo de equilibrio adecuado son cruciales para el mantenimiento de la integridad del tejido y evitar el plegado y lágrimas. La selección de la matriz y la técnica de aplicación tendrá un papel en la determinación de los tipos de analitos que se detecten, ...

El creciente campo de la metabolómica tiene muchas aplicaciones biológicas importantes, incluyendo el descubrimiento de biomarcadores, descifrando las vías metabólicas en plantas y otros sistemas biológicos, y la toxicología de perfiles 4,6-10. Un reto técnico importante en el estudio de los sistemas biológicos es el estudio de las vías de metabolómica sin interrumpir los 11. MALDI-MSI permite el análisis directo de los tejidos intactos que permite la detección sensible de analitos en órganos individuales 12,13 e incluso células individuales 14,15. Preparación de la muestra es un paso crucial en la producción de imágenes espectrales de masa reproducibles y fiables. La calidad de las imágenes depende en gran medida de factores tales como el tejido medio de incrustación, grosor de corte, matriz de MALDI, y la técnica de aplicación de la matriz. Para aplicaciones de formación de imágenes, espesor de corte ideal es la anchura de una celda (8-20 micras dependiendo del tipo de muestra). MALDI requiere el depósito de una orgánica, cristalinacompuesto matriz E, típicamente un ácido débil, en la muestra para ayudar a la ablación analito y la ionización. 16 Diferentes matrices de proporcionar diferentes intensidades de señal, iones interferentes, y la eficiencia de ionización de diferentes clases de compuestos. La técnica de aplicación de la matriz también juega un papel en la calidad de las imágenes espectrales de masa y diferentes técnicas son apropiadas para diferentes clases de analitos. Tres métodos de aplicación de la matriz se presentan en este protocolo: aerógrafo, rociador automático, y la sublimación. Aplicación de la matriz del aerógrafo ha sido ampliamente utilizado en la formación de imágenes de MALDI. La ventaja de la aplicación de la matriz del aerógrafo es que es relativamente rápido y fácil. Sin embargo, la calidad de la aplicación de la matriz aerógrafo depende en gran medida de la habilidad del usuario y tiende a ser menos reproducible y causar la difusión de analitos, especialmente moléculas pequeñas 17. Los sistemas automáticos de rociadores tienen los mecánicos similares a aerógrafo aplicación de la matriz, pero have sido desarrollado para eliminar la variabilidad observada con la aplicación manual de aerógrafo, haciendo que la pulverización más reproducible. Este método puede ser a veces más tiempo que la aplicación de la matriz aerógrafo tradicional. Tanto los sistemas de rociadores automáticos aerógrafo manual y son los métodos de aplicación de la matriz a base de solventes. La sublimación es una técnica de aplicación matriz seca que se está volviendo más y más popular para la formación de imágenes de espectro de masas de los metabolitos y moléculas pequeñas, ya que reduce la difusión del analito, sin embargo, carece de la necesaria disolvente para extraer y observar compuestos de masas superiores 18. Identificación Confiado de metabolitos normalmente requiere mediciones precisas de masa para obtener identificaciones putativos seguido de masas en tándem (MS / MS) experimentos de validación, con MS / MS espectros que se comparan con los estándares, la literatura, o espectros teóricos. En este protocolo de alta resolución (masa poder de resolución de 60.000 a m ​​/ z 400), cromatografía líquida (LC)-MS está acoplado a MALDI-MSI para obtener tanto la información espacial y las identificaciones seguras de metabolitos endógenos, utilizando Medicago truncatula raíces y nódulos de las raíces como el sistema biológico. Experimentos MS / MS se pueden realizar directamente en el tejido con MALDI-MSI o en extractos de tejidos con LC-MS y utilizados para la validación de la identificación de metabolitos. Este protocolo proporciona un método simple para mapear metabolitos endógenos en M. truncatula, que puede ser adaptada y aplicada a MSI de pequeñas moléculas en diversos tipos de tejidos y los sistemas biológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gelatin</td>
			<td style="width:181px;">Difco</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td>
			<td style="width:611px;">heat to dissolve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat- HM 550</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:163px;">956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">indium tin oxide (ITO)-coated glass slides&#160;</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25-75-0.8 mm (width-length-thickness)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx?ItemID=1787195">PI90033</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Airbrush</td>
			<td>Paasche Airbrush Company</td>
			<td>TG-100D</td>
			<td>coupled with 75 ml steel container</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td style="width:163px;">HTX.TMSP.H021-U</td>
			<td>Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sublimation apparatus&#160;</td>
			<td>Chemglass Life Science</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>Ultimate Pressure = 1x10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:163px;">276601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">FlexImaging</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td>269841</td>
			<td>One example of &#34;vender specific software&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MALDI LTQ Orbitrap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td>
			<td>High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Q Exactive</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maldi-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in medicago truncatula root nodules

La mayoría de las técnicas que se utilizan para estudiar las moléculas pequeñas, tales como fármacos o metabolitos endógenos, emplean extractos de tejidos que requieren la homogeneización del tejido de interés que podrían causar cambios en las rutas metabólicas en estudio 1. De formación de imágenes de espectrometría de masas (MSI) es una poderosa herramienta analítica que puede proporcionar información espacial de analitos dentro de rebanadas intactas de muestras de tejidos biológicos 1-5. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para estudiar diferentes tipos de compuestos, incluyendo proteínas, péptidos, lípidos, y moléculas pequeñas tales como metabolitos endógenos. Con láser asistida por matriz de desorción / ionización (MALDI)-MSI, distribuciones espaciales de múltiples metabolitos pueden ser detectados simultáneamente. En esto, un método desarrollado específicamente para la realización de experimentos no orientados metabolómica MSI en las raíces de leguminosas y nódulos de las raíces se presenta lo que podría revelar una visión de los procesos biológicos que tienen lugar. Lamétodo presentado aquí muestra un típico flujo de trabajo de MSI, de preparación de la muestra para la adquisición de imágenes, y se centra en la etapa de aplicación de la matriz, lo que demuestra diversas técnicas de aplicación de la matriz que son útiles para la detección de moléculas pequeñas. Una vez que las imágenes son generadas con EM, se discutieron y demostraron el análisis y la identificación de los metabolitos de interés. El flujo de trabajo estándar que aquí se presenta se puede modificar fácilmente para diferentes tipos de tejidos, especies moleculares, y la instrumentación.

Una visión general experimental de MSI se muestra en la Figura 1. Al principio del experimento, la preparación de la muestra es un paso crítico. Los nódulos se recortan de la raíz de la planta y embebidos en gelatina. El tejido debe ser presionada plana contra la copa criostato, sin burbujas, mientras se está congelado, ya que asegura una alineación más fácil y adecuada del tejido mientras se está seccionado. Cuando se está en rodajas el tejido, es importante para cortar el tejido en el espes...

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MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

De formación de imágenes de espectrometría de masas (MSI) es una herramienta poderosa que se puede utilizar para descubrir e identificar varias especies químicas en los tejidos intactos, la preservación de los compuestos en sus ambientes nativos, que puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los procesos biológicos. En la presente memoria un método de MSI desarrollado para el análisis de moléculas pequeñas se describe.

Imaging MALDI espectrometría de masas para la Investigación de metabolitos en<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; nódulos de las raíces

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

18.8K vistas.  University of Wisconsin- Madison.  De formación de imágenes de espectrometría de masas (MSI) es una herramienta poderosa que se puede utilizar para descubrir e identificar varias especies químicas en los tejidos intactos, la preservación de los compuestos en sus ambientes nativos, que puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los procesos biológicos. En la presente memoria un método de MSI desarrollado para el análisis de moléculas pequeñas se describe. 

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Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) plasmid. A. rhizogenes can cause hairy root formation on plant tissues and form composite plants after transformation. On these composite plants, some of the regenerated roots are transgenic, carrying the wild type T-DNA and the engineered binary vector; while the shoots are still non-transgenic, serving to provide energy and growth support. These hairy root composite plants will not produce transgenic seeds, but there are a number of important features that make these composite plants very useful in plant research. First, with a broad host range,A. rhizogenes can transform many plant species, especially dicots, allowing genetic engineering in a variety of species. Second, A. rhizogenes infect tissues and explants directly; no tissue cultures prior to transformation is necessary to obtain composite plants, making them ideal for transforming recalcitrant plant species. Moreover, transgenic root tissues can be generated in a matter of weeks. For Medicago truncatula, we can obtain transgenic roots in as short as three weeks, faster than normal floral dip Arabidopsis transformation. Overall, the hairy root composite plant technology is a versatile and useful tool to study gene functions and root related-phenotypes. Here we demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species M. truncatula.

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

We demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species Medicago truncatula.

Generación de plantas compuestas en Medicago truncatula Utilizado para los ensayos nodulación

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) ...

Investigación

Biología

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

La Ex vivo Preparación aislada Microvessel esquelético para la Investigación de la reactividad vascular

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificación de las transcripciones y los metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabezales

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution of efflux pumps from the Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa in a biomimetic environment that allows for an accurate investigation of their activity of transport. Three prerequisites are fulfilled: compartmentation in a lipidic environment, use of a relevant index for transport, and generation of a proton gradient. The membrane protein transporter is reconstituted into liposomes together with bacteriorhodopsin, a light-activated proton pump that generates a proton gradient that is robust as well as reversible and tunable. The activity of the protein is deduced from the pH variations occurring within the liposome, using pyranin, a pH-dependent fluorescent probe. We describe a step-by-step procedure where membrane protein purification, liposome formation, protein reconstitution, and transport analysis are addressed. Although they were specifically designed for an RND transporter, the described methods could potentially be adapted for use with any other membrane protein transporter energized by a proton gradient.

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

We present a protocol for the in vitro investigation of efflux pumps from Pseudomonas aeruginosa. This protocol allows for the generation of a robust, reversible, and tunable proton gradient within the liposome membrane and hence should be adaptable to any membrane protein energized by the protomotive force.

In vitro Investigación de la bomba de salida MexAB De Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Sincronización de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Para la Investigación del Ciclo Celular Bacteriana

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Contractilidad Mediciones en músculos papilares aislados para la Investigación de Cardíaca inotropía en ratones

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Preparación de muestras para perfiles metabólicos utilizando imágenes de espectrometría de masas MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

Divergencia de la microbiota radicular en diferentes hábitats basada en redes de correlación ponderadas

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...