Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención DP2OD008470.

Los procedimientos para trabajar con embriones de pez cebra que se describen en este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Notre Dame. 1. Preparación de Ringer Solución <ol><li> Prepare una solución de NaCl 116 mM, 2,9 mM KCl, 3,6 mM CaCl 2 y 5 mM Hepes con ultrapura H2O través agitación continua para evitar la precipitación de sales. </li><li> Después de la adición de sales y mientras la solución todavía se agita, añadir 100 unidades / ml de penicilina y por 100 g de estreptomicina por ml. </li><li> Después de añadir todos los antibióticos y sales, realice la esterilización del filtro de la solución y almacenar en el recipiente estéril. Nota: N-feniltiourea (1-fenil-2-tiourea) o PTU se pueden añadir a la solución de Ringer para bloquear la formación de pigmento en grano embriones implantados sin consecuencias negativas para la salud del embrión. Para preparar la solución de bloqueo / pigmentación de Ringer, use un concentración de 0,003% PTU. Debido a la baja concentración de la PTU que se añade, se aconseja que un mayor volumen de solución de Ringer hacerse, por lo menos 1 L, para evitar la adición de cantidades minúsculas de polvo PTU. Añadir PTU durante el paso 1.2, mientras que la solución se agitaba. </li></ol> 2. Preparación de la solución tricaína <ol><li> Añadir 2 g de acetato de 3-aminobenzoato de sal metanosulfonato (tricaína) por L de solución 0,1 M Tris además, de un stock de 1 M equilibrada a un pH de 9,5 y hecho con ultrapura H 2 O. Nota: tricaína será utilizado para la eutanasia de los embriones de pez cebra en el punto de tiempo deseado para ensayar fenotipos implantación de bolas. </li></ol> 3. Preparación de la solución E3 <ol><li> Hacer una solución de NaCl 0,25 M, KCl 10 mM, 12,5 mM CaCl 2, y 16,6 mM MgSO 4 a 1 L de agua ultrapura para crear 1 L de E3. </li><li> Añadir 200 l de azul de metileno a la solución E3 para inhibir el crecimiento de hongos. </li></ol>4. Agujas Pulling para Microbead Transferencia <ol><li> Use fuego pulido de vidrio de borosilicato con filamento a una OD: 1,0 mm, ID: 0,5 mm, en una longitud de 10 cm. </li><li> Coloque el vidrio borosilicatado en un extractor de micropipeta para preparar finas agujas. Nota: Los siguientes cuatro dimensiones se pueden utilizar como punto de partida para tirar de las agujas: Calor = 540, Pull = 245, Velocidad = 200, y el Tiempo = 125. </li><li> Después de tirar un número adecuado de agujas, almacenar en plástico cubierto placas petri, colocados en tiras de plastilina o cinta adhesiva para evitar romper la punta de la aguja, hasta su uso. </li><li> Para recortar la punta de la aguja al tamaño orificio deseada, utilice un par de pinzas finas para anotar el extremo de la aguja. Nota: Tamaño de la aguja orificio variará dependiendo del tamaño de microperlas siendo utilizado así como las preferencias de manipulación de usuario. Un buen punto de partida es diámetros embarcación en un rango entre 100 y 200 micras si se utilizarán microperlas que van desde 50 hasta 100 micras. </li><li> Príor de usar, inserte la aguja recortado en el soporte de tubo capilar a la moda del instrumento de transferencia microperla completado. </li></ol> 5. Bigote / Lash Preparación Herramienta <ol><li> Obtener un pelo, latigazo, u otra pieza pequeña pero firme de filamento de cabello natural o sintético. Cortar cerca de la base del filamento en un ángulo de 45 °. Adherirse la barba a una punta de micropipeta P-1000 con pegamento adhesivo transparente permanente. </li></ol> 6. Microbead Implantación Preparación bandeja <ol><li> Mezclar 2 g de agarosa con 100 ml de solución de E3 para hacer una E3 gel de agarosa al 2%. </li><li> Calentar la solución de agarosa al 2% durante 1 min y 30 seg en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, agitando el matraz cada 30 seg para evitar el gel de burbujeo terminado. </li><li> Tome la tapa de un 60 mm x 15 mm placa de Petri y colocarlo en un mayor de 150 mm x 15 mm plato con el interior hacia arriba. </li><li> Verter el gel de agarosa caliente en el 150 mm x 15 mm placa de Petri, asegurándose de anclar abajola tapa del plato más pequeño con el dedo índice. Nota: Permitir una capa delgada de agarosa por debajo de la tapa del plato más pequeño para eliminar la condensación que se forma cuando se vierte el gel; esto hará que las perlas más fácil de ver bajo un microscopio de disección. </li><li> A medida que la agarosa se enfría, pero antes de que se solidifica, colocar un molde bien en el gel. Esto permitirá la colocación más fácil de los embriones. </li><li> Nota: Con el fin de evitar burbujas en los pozos, colocar el molde lentamente en un ángulo hasta que está flotando en la parte superior del gel. </li><li> El uso de un microespátula, retire con cuidado el molde bien una vez que el gel se ha solidificado. Añadir solución E3 y almacenar a 4 ° C. </li></ol> 7. Embryo Collection <ol><li> Preparar cámaras de apareamiento, separados por divisores, llenándolos con agua del sistema, y ​​luego colocar adulto hembra (s) pares masculinos pez cebra (s) y en las cámaras de O / N. </li><li> Recoge los huevos fertilizados utilizando un colador de malla de alambre fino (etapas embrionarias pueden variar ligeramente). </li><li> Depositar los huevos fertilizados en un, 10 cm de diámetro placa de Petri limpia girando el colador boca abajo y enjuagar con un chorro fino de E3 hasta que no hay huevos que quedan en el tamiz, y hay aproximadamente 25 ml de solución de E3 en el plato. </li><li> Después de la recogida, divida los huevos en varios platos (aproximadamente 50 a 60 huevos por plato) para evitar el hacinamiento, lo que podría conducir a la asincronía del desarrollo dentro del embrague y realizar la recogida de puntos deseados veces difícil. </li><li> Incubar los embriones en solución E3 a 28,5 ° C para permitir la evaluación del desarrollo de acuerdo con la norma serie estadificación pez cebra 40. Nota: Los embriones deben ser transferidos a E3 / PTU a 24 h después de la fecundación (HPF) para prevenir el desarrollo de pigmento si manipulaciones en las etapas de mayor edad necesitan claridad óptica. </li></ol> 8. Implantación del grano <ol><li> Incubar las microperlas en la concentración de molécula de ensayo deseada o el correspondiente s vehículoolución durante el tiempo necesario en un volumen apropiado. Nota: El investigador puede usar placas de Petri estériles que van 3-6 cm de diámetro, o placas de múltiples pocillos, ambos de los cuales permiten la visualización de las microperlas dentro de la solución. El tiempo puede variar en función del tipo y la cantidad de molécula de interés, y el investigador debe hacer referencia a fabricante o recomendaciones publicadas por la duración de la incubación y otros aspectos como la sensibilidad a la luz y la temperatura. </li><li> Una vez que los embriones han alcanzado el punto de tiempo de desarrollo deseado, retire los embriones de sus chorions utilizando unas pinzas finas. </li><li> Incubar los embriones en la solución de Ringer filtrada con antibióticos durante 10 min para aclimatarse a la solución. </li><li> Mientras que los embriones son aclimatando, transferir las microperlas en la placa microperla enclavado dentro de la bandeja de implantación y enjuagarlos en solución Ringer durante 10 min. Nota: Implante las cuentas dentro de 50 minutos después de llegar a este punto. Esta wenfermo disminuir la probabilidad de que uno implantar un cordón con una concentración más pequeña de la molécula de interés. </li><li> Matriz de los embriones en los pocillos de la bandeja de la implantación microperla, teniendo cuidado de orientarlas de manera que el área de interés, donde la microperla será implantado es accesible. </li><li> Hacer una pequeña incisión en el embrión utilizando la aguja de tungsteno. </li><li> Transferir una microperla en el embrión utilizando la pipeta de transferencia microcapilar: presionando el bulbo de la pipeta, tire suavemente de la microperla en la columna capilar, y luego liberar la presión para transferir la microperla en el destino deseado. </li><li> Utilice la herramienta de la barba / pestañas para posicionar la microperla dentro del embrión. Nota: Asegúrese de colocar la microperla en el tejido fuera del sitio de la incisión por lo que el microperla no será expulsado del embrión a medida que sana. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Durante el siglo pasado, la comprensión de los patrones plan corporal y la organogénesis ha experimentado avances monumentales. Técnicas de manipulación de tejidos fueron críticos en el descubrimiento de la información clave acerca de estos procesos vitales. La modificación genética es uno de los métodos más utilizados para determinar la función de genes, y los métodos de análisis de mosaico, como el trasplante de células, proporcionan enfoques útiles para entender la autonomía de la función génica. Implantación Microbead ofrece otro lugar para interrogar cómo las moléculas particular, altera la dinámica del desarrollo, ya que este método permite al investigador para alterar un entorno local de los tejidos mediante la introducción de moléculas o inhibidores de la señalización. Una gama de diferentes microperlas están disponibles comercialmente, que han existir diferentes tamaños y otras propiedades físicas (por ejemplo, carga) de modo que se pueden emplear para para las condiciones experimentales de interés. De este modo, mediante la implantación de microperlas que se remojan en una proteína o químicocal de interés dentro de un organismo, los investigadores pueden investigar los efectos localizados durante el desarrollo y encontrar asociaciones entre el gen o molécula de interés y en particular fenotipo biológico (s). Estudios como el realizado por la AMA y colegas utilizado implantación microperla con el fin de evaluar el efecto del aumento de la señalización de Hedgehog en el patrón esquelético en el neurocranium anterior (ANC) en el pez cebra 23. Estudios anteriores han demostrado que Shh es necesario para la formación de ANC 14. Uso de microperlas recubiertas con Shh investigadores identificaron que esta señal promueve la formación de cartílago en el ANC. Se utilizó el proceso de implantación microperla para demostrar un vínculo claro entre erizo de señalización y la formación de cartílago en el ANC. Otro ejemplo clave de esta técnica de manipulación de tejidos en el pez cebra se observa en los estudios donde los científicos investigaron el control transcripcional del eritroblastoma Veintiséis (ETS) de dominio fmolécula relacionada con ETS actores (ERM) y Polioma potenciador activador 3 (PEA3) por la señalización FGF durante principios de desarrollo del cerebro de pez cebra 19. A través de experimentos de implantación microesferas, que fueron capaces de demostrar que Fgf8 y Fgf3 pueden activar ectópica expresión de erm y PEA3. Estos ejemplos ilustran la utilidad de microperlas para proporcionar conocimientos sobre los mecanismos de desarrollo que colaboran durante la formación de tejido, que puede ser bien caracterizado por el uso de métodos para evaluar la expresión del gen 41. Por lo tanto, el trasplante de microperlas puede ser un método viable para explorar otros tejidos, tales como el mesodermo intermedio (IM) que da lugar al riñón. En concreto, se ayudaría a los estudios de desarrollo renal, para investigar cómo las diferentes moléculas afecta nefrona segmentación 42 y tubulogenesis 43,44, los procesos que se entienden sólo superficialmente en la actualidad. Además, la implantación de microperlas ha comenzado a ser utilizado al perno prisioneroprocesos de regeneración y en el pez cebra 29] y podrían ser adaptados para su uso con cualquier número de modelos de la regeneración de órganos, tales como después de la ablación con láser de tejidos embrionarios como la nefrona 45 o en conjunción con métodos que se han formulado para llevar a cabo la investigación con las estructuras adultas correspondientes 46-49. Finalmente, la implantación de microperlas tiene el potencial de ser utilizado en los modelos de enfermedades humanas, tales como el cáncer o tejido 50,51 52,53 degeneración. En el presente protocolo, se demuestra el método de implantación microperla en embriones de pez cebra, que también ha sido descrito de manera similar por otros investigadores, pero no se muestra a través de protocolos de video 1. Con la práctica mínima pudimos implantar microperlas a un ritmo aproximado de 8 a 10 embriones / h, que relaciona la viabilidad de este procedimiento una vez que el investigador tiene un poco de experiencia. Los resultados que se muestran en este documento demuestran que las perlas de diversos dimensiones se pueden implantar en las primeras etapas, y que con cuidado, esta técnica manipulación de los tejidos se pueden implementar con una interrupción física mínima para el embrión. Una mejora que se debe destacar es el uso de una herramienta whisker / pestañas para posicionar la microperla en el embrión. Esta pieza relativamente barato y simple de equipo es de aproximadamente el mismo diámetro que la microperla, es fácil de obtener y ayuda a acelerar el proceso de implantación. La barba / pestañas se puede cortar a una longitud deseada para producir una firma pero delicada herramienta de manipulación bead-, dependiendo de la destreza investigador y preferencia. Por último, mientras que describimos aquí cómo manipular físicamente microperlas y embriones de pez cebra para llevar a cabo la implantación, este protocolo no describe los procedimientos de manipulación específicas para diferentes fármacos o péptidos. En general, microperlas tratadas químicamente deben ser implantadas en el animal con la conveniencia, para evitar efectos no deseados en otras zonas del organismo, y los investigadores deben estar bien enformada por los posibles problemas de seguridad asociados con tales productos químicos antes de iniciar sus estudios. En resumen, hemos demostrado un método de implantación de microperlas relativamente simple y eficiente con una amplia gama de aplicaciones que utilizan materiales que están fácilmente disponibles en el laboratorio. En última instancia, esperamos que este manual ayudará a los investigadores a la naturaleza delicada de manipulación de los tejidos del pez cebra.

Investigadores de la biología del desarrollo utilizan una amplia gama de métodos celulares, moleculares y genéticos para descubrir los mecanismos que controlan cómo se forma un organismo. Entre estos enfoques, manipulación de los tejidos es una herramienta clave en el desciframiento de preguntas complejas sobre el destino celular, movimiento celular, y la organización de los tejidos. Una manera de alterar entornos tisulares locales es a través de la aplicación quirúrgica de microperlas que se utilizan para entregar una fuente focal de proteínas u otras moléculas de señalización 1. Este tipo de manipulación experimental ha sido ampliamente aplicado en modelos embriología vertebrados clásicos, como la rana y el polluelo 2. El pez cebra se ha convertido en un importante organismo modelo para el estudio de los vertebrados de organogénesis y también proporciona muchas ventajas únicas para el modelado de la enfermedad 3-5, ya que comparten alta conservación genética con los humanos 6. En particular, la transparencia óptica y exel desarrollo interno del embrión de pez cebra ofrece un punto de vista sin igual para la observación de la ontogenia tejido 3-5. La implementación de las pantallas adelante genéticos a gran escala ha generado un poderoso depósito de cepas mutantes de pez cebra para el estudio adicional 7,8, y la identificación de las técnicas de detección alternativos que pueden llevarse a cabo de manera eficiente a escala reducida en los laboratorios individuales 9,10. Más trabajo experimental con el pez cebra se ha facilitado gracias a los avances en las metodologías transgénicas y revertir enfoques genéticos 11,12, así como la genética química 13-15. Técnicas de manipulación de los tejidos, tales como la aplicación de microperlas, no han sido tan ampliamente empleado en el pez cebra, pero, no obstante, proporcionar una herramienta útil para comprender mejor la señalización celular durante el desarrollo. Implantación Microbead se ha utilizado para interrogar a los procesos de formación de órganos en la retina de pez cebra16,17, 18 de corazón, cerebro 19-22, cresta neural 23, y la aleta 24,25. En estos y otros estudios, los granos se han aplicado durante el desarrollo para entender la difusión de moléculas de señalización 26, cómo gradientes afectan la migración celular 27 y el patrón axial 28. Más recientemente, microperlas se han utilizado para evaluar los mecanismos de regeneración en adultos de pez cebra 29. En estudios de desarrollo, por ejemplo, el trabajo microperla pez cebra ha proporcionado una visión de los mecanismos de formación de las extremidades a través de estudios de la aleta pectoral 25. El brote aleta pectoral pez cebra es homóloga a la yema de la extremidad anterior en el ratón 30 y 31 del polluelo. El esbozo de la extremidad de los vertebrados tiene dos nodos esenciales de señalización: la zona de actividad polarizante (ZPA) que establece el eje antero-posterior a través de la expresión de Sonic hedgehog (Shh) y objetivos de genes Hox aguas abajo,y la cresta ectodérmica apical (AER) presente en la punta de la yema de la extremidad, que actúa para establecer proximal a la identidad de la extremidad distal a través de la expresión de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Mediante la implantación de microesferas de FGF empapadas en pez cebra mutantes genéticos Shh, investigadores FGF identificado como esencial para la progresión del ciclo celular y el crecimiento de la extremidad de vertebrados 25. Además de Fgf cascadas de señalización de Shh y que establecen la identidad posicional, estudios pioneros utilizando el primordio de la extremidad del polluelo identificado el ácido retinoico (RA) como una molécula que podría imitar la acción de la región de polarización para establecer la identidad anterior a posterior 32. Estos experimentos implicados colocando pequeñas tiras de papel Whatman empapado-RA en la extremidad de pollo para evaluar los patrones dígitos 32. Además, los investigadores han realizado otros estudios elegantes que emplean el uso de microperlas, el trasplante de células, y exógenoTratamientos con AR en el pez cebra para determinar que la AR actúa para proporcionar largo alcance señales posicionales en el cerebro posterior pez cebra y mesodermo 28. Sin embargo, en la actualidad quedan muchas preguntas acerca de los roles de factores como FGF y RA de señalización durante numerosos aspectos del desarrollo de los vertebrados. Los efectos de señalización de la AR, actuando como un morfógeno, afectan muchos órganos 33, como el corazón en desarrollo 34 y los progenitores renales, donde RA especifica células renales proximales tipo destinos 35-39. Una mayor comprensión de este tipo de temas podría beneficiarse significativamente de los estudios experimentales utilizando técnicas de manipulación de tejidos y de implantación microperla. Mientras que un menor número de estudios se han realizado con la implantación microperla en el pez cebra, en comparación con modelos como el pollo, las que se han llevado a cabo han sido muy informativo. Una razón de la escasez de la implantación microperla-investigación basada en el embrión de pez cebra es likely la noción de que hay desafíos técnicos difíciles, basado en el tamaño del embrión, que constituyen un impedimento para realizar con éxito tales manipulaciones. Sin embargo, la implantación de microperlas en embriones de pez cebra se puede aprender con la práctica y asistido través de la observación visual de la técnica, y por lo tanto puede llevarse a cabo como un medio para interrogar a los mecanismos de desarrollo. Aquí, demostramos la aplicación precisa de una microperla en el embrión de pez cebra, que puede ser utilizado para la realización de una amplia variedad de ensayos sobre la formación de tejido y la morfogénesis celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FB-500-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21-401-50B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2707402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethly Sulfoxide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45-106 &#181;m)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>140-1454 AG1-X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45 &#181;m)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>7314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube holder</td>
			<td>Globe Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>51674</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

El pez cebra se ha convertido en un valioso sistema de modelo genético para el estudio de la biología del desarrollo y la enfermedad. El pez cebra comparten un alto grado de conservación genómica, así como similitudes en los procesos celulares, moleculares y fisiológicas, con otros vertebrados, incluyendo los seres humanos. Durante la ontogenia temprana, embriones de pez cebra son ópticamente transparente, permitiendo a los investigadores visualizar la dinámica de la organogénesis utilizando un sencillo microscopio estereoscópico. Implantación Microbead es un método que permite la manipulación de tejido a través de la alteración de los factores en entornos locales. Esto permite a los investigadores a ensayo los efectos de cualquier número de moléculas de señalización de interés, tales como péptidos secretados, en los puntos espaciales y temporales específicos dentro del embrión en desarrollo. Aquí, detallamos un protocolo de cómo manipular y cuentas de implantes durante el desarrollo del pez cebra temprano.

Varios tipos de herramientas de manipulación son útiles para el manejo de microperlas durante aplicaciones de investigación (Figura 1). Además, un molde de agarosa simple con pozos pequeños se puede utilizar para mantener el embrión de pez cebra, que es vital para llevar a cabo estos experimentos de manera oportuna y eficiente (Figura 1). La implantación de una microperla se puede realizar en la posición espacial y la etapa temporal de interés, lo que permite a los investigadores estrechen una ventana de acción específico para la molécula de interés. Aquí, microperlas individuales se implantaron en embriones de pez cebra en la etapa de cola brote o en posteriores puntos de tiempo durante las etapas somitogenesis (Figura 3). Dos microperlas de diferentes tamaños, se enjuaga con solución de Ringer solo, se utilizaron en este protocolo de demostración (Figura 3A, 3B y 3C). Esta implantación microbead en ausencia de cualquier conjugadopequeñas moléculas demuestra que la implantación de bolas puede lograrse sin efectos morfológicos brutos durante el desarrollo adecuado del embrión de pez cebra (Figura 4). El experimentador puede encontrar dificultades con la maniobra de la microperla en el orificio de punción realizada por una aguja de tungsteno encima del embrión. Para lograr un mejor manejo de la microperla una vez colocado en el embrión por el micro-aguja, a / herramienta de pestañas whisker se puede utilizar. Esto puede ser elaborado con arrojar naturalmente felino o canino bigotes, aunque otros filamentos pestañas naturales o sintéticos pueden ser utilizados (Figura 1). Un suave empujón del microperla, ya sea con la aguja de tungsteno o la herramienta de la barba debe ver la microperla hundirse en la solución de Ringer del molde. Una vez que el microbead se ha hundido en el molde que se debe mover grandes distancias si es necesario utilizando la aguja de tungsteno y una vez encima de la del embrión, la herramienta de la aguja o de la barba se puede utilizar para position la microperla en el embrión. El éxito de la implantación de microperlas se puede medir inmediatamente a través de la visualización en un microscopio estereoscópico, ya que el grano se mantendrá de forma estable posicionado en el tejido. Para evaluar la posición de talón con el tiempo, cada muestra embrión se pueden obtener imágenes a través de Live tiempo-curso de fotografía o comprueba a intervalos periódicos (tal como se representa en la Figura 4) para asegurar que la ubicación de talón no se ha desplazado durante la duración del experimento debido al tejido endógeno morfogénesis. La comprensión de la posición de la perla en el tiempo es crítico para la interpretación más informada de los resultados, tales como la evaluación del efecto de una molécula pequeña en un tejido diana o proceso de desarrollo. El uso de estos pasos anteriores proporcionará un entorno ideal para incrustar microperlas en el embrión de pez cebra a la vez y posición deseada. En nuestra experiencia, los usuarios novatos de este protocolo de implantación microperla normalmente ganaron el ne habilidadnece- para llevar a cabo la implantación quirúrgica consistente de microperlas en el embrión de pez cebra después de aproximadamente una semana de la práctica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> Figura 1. Herramientas utilizadas para llevar a cabo la implantación microperla. (A) La bandeja de la implantación de bolas (izquierda, 15 cm de diámetro) con moldes de embriones (a la izquierda) y una bandeja de incubación microperla (a la derecha, 6 cm de diámetro). Esta bandeja de trabajo permite al investigador para colocar los embriones en la orientación deseada para la implantación de microperlas, y para tener las microperlas preparados para la implantación en estrecha proximidad a la estación de microscopio. Microperlas deben incubarse en pequeña molécula (s) y / o vehículo y luego se enjuagaron en una placa separada de microperlas (derecha) antes de colocarlos en la bandeja de la implantación de bolas que se coloca debajo de la estación microscopio. (B) Dos pares de pinzas finas se utilizan para eliminar el Chorien torno a cada embrión de pez cebra y también para romper el extremo de la aguja microcapilar. Se empleará (C) Una aguja de tungsteno para hacer una punción muy fino en el embrión de pez cebra en el que para posicionar la microperla. (D) La pipeta de transferencia microcapilar será utilizado para recoger y colocar una microperla en la parte superior del embrión de pez cebra cerca del sitio de la punción. (E) La herramienta bigote / pestañas permitirá el posicionamiento suave de la microperla en el sitio de la incisión en el embrión que se hizo previamente por la aguja de tungsteno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> Figura 2. Representación esquemática del procedimiento de implantación de microperlas. (A) Una bandeja de implantación de microperlas con microperlas soaking en la solución de lavado deseado está configurado bajo un microscopio estereoscópico estación, y los embriones posicionada con el tejido hacia arriba. (B) Usando una aguja de tungsteno, de una pequeña incisión en el embrión se puede hacer con un ligero movimiento todavía contundente. (C) Con una pipeta de transferencia microcapilar, la microperla deseado puede ser recogido de la cámara de incubación microperla en la bandeja, situado a la derecha, y trajo al compartimento izquierdo donde el área de trabajo embrión se encuentra. El microbead debe ser depositado cerca del sitio de la incisión, a continuación, coloca suavemente en el sitio de la incisión hecha por la aguja de tungsteno utilizando el / herramienta de pestañas whisker. Una vez que una microperla es maniobrado en el sitio de la incisión, debe ser metido en el tejido (lejos de la incisión) en la posición de forma estable la microperla y evitar el movimiento subsiguiente de la embrión como el desarrollo continúa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>arrendar clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> Figura 3. microperlas pueden ser implantados en embriones en diferentes etapas de desarrollo. (A) embriones de pez cebra fueron implantados con una microperla (diámetro de aproximadamente 50 micras) en el tronco en la fase de brote de la cola. Cuando se examina en el implante poste de talón 24 hr (hpbi), los embriones habían desarrollado normalmente y la microperla mostró un mínimo movimiento durante el paso del tiempo de desarrollo. (B) los embriones de pez cebra implantados con microperlas (con un diámetro de aproximadamente 50 micras) en el saco de yema en la etapa 3 somite (ss) muestran un desarrollo normal con el movimiento del grano relativamente menor con el tiempo. (C) microperlas más grandes (diámetro de aproximadamente 70 micras) se implantaron en el embrión 7 ss de manera similar mostró posterior desarrollo normal, así como minimal si cualquier movimiento desde el lugar de implantación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> Figura 4. desarrollo bruto del embrión de pez cebra es perturbada por la presencia de una microperla a través de 72 hpbi. Embriones de pez cebra fueron implantados con microperlas empapados en solución de Ringer (con un diámetro de aproximadamente 50 micras) en la etapa 7 somite (ss). Cada microperla se inserta quirúrgicamente en el tronco, entre los somitas 3 y 4. La presencia de la cuenta no se asoció con defectos evidentes de desarrollo a 24 horas después del implante del grano (hpbi), 48 hpbi o 72 hpbi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a>

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.0K vistas.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Video: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

La microinyección de embriones y la electroporación en el Chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM y Microrheology en la celda de yema de embrión de pez cebra

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

Eficacia de la extracción de aire en dos peces salmónidos, trucha arco iris (Oncorhynchus Mykiss) y trucha (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Siguientes movimientos de tejido endocárdico vía Photoconversion de la célula en el embrión de pez cebra

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema basado en la microinyección en Vivo implantación de cardiomiocitos embrionarios en el embrión aviar

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...