Name: microbead implantation in the zebrafish embryo
Uploaded: 2015-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención DP2OD008470.

Los procedimientos para trabajar con embriones de pez cebra que se describen en este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Notre Dame. 1. Preparación de Ringer Solución <ol><li> Prepare una solución de NaCl 116 mM, 2,9 mM KCl, 3,6 mM CaCl 2 y 5 mM Hepes con ultrapura H2O través agitación continua para evitar la precipitación de sales. </li><li> Después de la adición de sales y mientras la solución todavía se agita, añadir 100 unidades / ml de penicilina y por 100 g de estreptomicina por ml. </li><li> Después de añadir todos los antibióticos y sales, realice la esterilización del filtro de la solución y almacenar en el recipiente estéril. Nota: N-feniltiourea (1-fenil-2-tiourea) o PTU se pueden añadir a la solución de Ringer para bloquear la formación de pigmento en grano embriones implantados sin consecuencias negativas para la salud del embrión. Para preparar la solución de bloqueo / pigmentación de Ringer, use un concentración de 0,003% PTU. Debido a la baja concentración de la PTU que se añade, se aconseja que un mayor volumen de solución de Ringer hacerse, por lo menos 1 L, para evitar la adición de cantidades minúsculas de polvo PTU. Añadir PTU durante el paso 1.2, mientras que la solución se agitaba. </li></ol> 2. Preparación de la solución tricaína <ol><li> Añadir 2 g de acetato de 3-aminobenzoato de sal metanosulfonato (tricaína) por L de solución 0,1 M Tris además, de un stock de 1 M equilibrada a un pH de 9,5 y hecho con ultrapura H 2 O. Nota: tricaína será utilizado para la eutanasia de los embriones de pez cebra en el punto de tiempo deseado para ensayar fenotipos implantación de bolas. </li></ol> 3. Preparación de la solución E3 <ol><li> Hacer una solución de NaCl 0,25 M, KCl 10 mM, 12,5 mM CaCl 2, y 16,6 mM MgSO 4 a 1 L de agua ultrapura para crear 1 L de E3. </li><li> Añadir 200 l de azul de metileno a la solución E3 para inhibir el crecimiento de hongos. </li></ol>4. Agujas Pulling para Microbead Transferencia <ol><li> Use fuego pulido de vidrio de borosilicato con filamento a una OD: 1,0 mm, ID: 0,5 mm, en una longitud de 10 cm. </li><li> Coloque el vidrio borosilicatado en un extractor de micropipeta para preparar finas agujas. Nota: Los siguientes cuatro dimensiones se pueden utilizar como punto de partida para tirar de las agujas: Calor = 540, Pull = 245, Velocidad = 200, y el Tiempo = 125. </li><li> Después de tirar un número adecuado de agujas, almacenar en plástico cubierto placas petri, colocados en tiras de plastilina o cinta adhesiva para evitar romper la punta de la aguja, hasta su uso. </li><li> Para recortar la punta de la aguja al tamaño orificio deseada, utilice un par de pinzas finas para anotar el extremo de la aguja. Nota: Tamaño de la aguja orificio variará dependiendo del tamaño de microperlas siendo utilizado así como las preferencias de manipulación de usuario. Un buen punto de partida es diámetros embarcación en un rango entre 100 y 200 micras si se utilizarán microperlas que van desde 50 hasta 100 micras. </li><li> Príor de usar, inserte la aguja recortado en el soporte de tubo capilar a la moda del instrumento de transferencia microperla completado. </li></ol> 5. Bigote / Lash Preparación Herramienta <ol><li> Obtener un pelo, latigazo, u otra pieza pequeña pero firme de filamento de cabello natural o sintético. Cortar cerca de la base del filamento en un ángulo de 45 °. Adherirse la barba a una punta de micropipeta P-1000 con pegamento adhesivo transparente permanente. </li></ol> 6. Microbead Implantación Preparación bandeja <ol><li> Mezclar 2 g de agarosa con 100 ml de solución de E3 para hacer una E3 gel de agarosa al 2%. </li><li> Calentar la solución de agarosa al 2% durante 1 min y 30 seg en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, agitando el matraz cada 30 seg para evitar el gel de burbujeo terminado. </li><li> Tome la tapa de un 60 mm x 15 mm placa de Petri y colocarlo en un mayor de 150 mm x 15 mm plato con el interior hacia arriba. </li><li> Verter el gel de agarosa caliente en el 150 mm x 15 mm placa de Petri, asegurándose de anclar abajola tapa del plato más pequeño con el dedo índice. Nota: Permitir una capa delgada de agarosa por debajo de la tapa del plato más pequeño para eliminar la condensación que se forma cuando se vierte el gel; esto hará que las perlas más fácil de ver bajo un microscopio de disección. </li><li> A medida que la agarosa se enfría, pero antes de que se solidifica, colocar un molde bien en el gel. Esto permitirá la colocación más fácil de los embriones. </li><li> Nota: Con el fin de evitar burbujas en los pozos, colocar el molde lentamente en un ángulo hasta que está flotando en la parte superior del gel. </li><li> El uso de un microespátula, retire con cuidado el molde bien una vez que el gel se ha solidificado. Añadir solución E3 y almacenar a 4 ° C. </li></ol> 7. Embryo Collection <ol><li> Preparar cámaras de apareamiento, separados por divisores, llenándolos con agua del sistema, y ​​luego colocar adulto hembra (s) pares masculinos pez cebra (s) y en las cámaras de O / N. </li><li> Recoge los huevos fertilizados utilizando un colador de malla de alambre fino (etapas embrionarias pueden variar ligeramente). </li><li> Depositar los huevos fertilizados en un, 10 cm de diámetro placa de Petri limpia girando el colador boca abajo y enjuagar con un chorro fino de E3 hasta que no hay huevos que quedan en el tamiz, y hay aproximadamente 25 ml de solución de E3 en el plato. </li><li> Después de la recogida, divida los huevos en varios platos (aproximadamente 50 a 60 huevos por plato) para evitar el hacinamiento, lo que podría conducir a la asincronía del desarrollo dentro del embrague y realizar la recogida de puntos deseados veces difícil. </li><li> Incubar los embriones en solución E3 a 28,5 ° C para permitir la evaluación del desarrollo de acuerdo con la norma serie estadificación pez cebra 40. Nota: Los embriones deben ser transferidos a E3 / PTU a 24 h después de la fecundación (HPF) para prevenir el desarrollo de pigmento si manipulaciones en las etapas de mayor edad necesitan claridad óptica. </li></ol> 8. Implantación del grano <ol><li> Incubar las microperlas en la concentración de molécula de ensayo deseada o el correspondiente s vehículoolución durante el tiempo necesario en un volumen apropiado. Nota: El investigador puede usar placas de Petri estériles que van 3-6 cm de diámetro, o placas de múltiples pocillos, ambos de los cuales permiten la visualización de las microperlas dentro de la solución. El tiempo puede variar en función del tipo y la cantidad de molécula de interés, y el investigador debe hacer referencia a fabricante o recomendaciones publicadas por la duración de la incubación y otros aspectos como la sensibilidad a la luz y la temperatura. </li><li> Una vez que los embriones han alcanzado el punto de tiempo de desarrollo deseado, retire los embriones de sus chorions utilizando unas pinzas finas. </li><li> Incubar los embriones en la solución de Ringer filtrada con antibióticos durante 10 min para aclimatarse a la solución. </li><li> Mientras que los embriones son aclimatando, transferir las microperlas en la placa microperla enclavado dentro de la bandeja de implantación y enjuagarlos en solución Ringer durante 10 min. Nota: Implante las cuentas dentro de 50 minutos después de llegar a este punto. Esta wenfermo disminuir la probabilidad de que uno implantar un cordón con una concentración más pequeña de la molécula de interés. </li><li> Matriz de los embriones en los pocillos de la bandeja de la implantación microperla, teniendo cuidado de orientarlas de manera que el área de interés, donde la microperla será implantado es accesible. </li><li> Hacer una pequeña incisión en el embrión utilizando la aguja de tungsteno. </li><li> Transferir una microperla en el embrión utilizando la pipeta de transferencia microcapilar: presionando el bulbo de la pipeta, tire suavemente de la microperla en la columna capilar, y luego liberar la presión para transferir la microperla en el destino deseado. </li><li> Utilice la herramienta de la barba / pestañas para posicionar la microperla dentro del embrión. Nota: Asegúrese de colocar la microperla en el tejido fuera del sitio de la incisión por lo que el microperla no será expulsado del embrión a medida que sana. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Durante el siglo pasado, la comprensión de los patrones plan corporal y la organogénesis ha experimentado avances monumentales. Técnicas de manipulación de tejidos fueron críticos en el descubrimiento de la información clave acerca de estos procesos vitales. La modificación genética es uno de los métodos más utilizados para determinar la función de genes, y los métodos de análisis de mosaico, como el trasplante de células, proporcionan enfoques útiles para entender la autonomía de la función génica. Implantación Microbead ofrece otro lugar para interrogar cómo las moléculas particular, altera la dinámica del desarrollo, ya que este método permite al investigador para alterar un entorno local de los tejidos mediante la introducción de moléculas o inhibidores de la señalización. Una gama de diferentes microperlas están disponibles comercialmente, que han existir diferentes tamaños y otras propiedades físicas (por ejemplo, carga) de modo que se pueden emplear para para las condiciones experimentales de interés. De este modo, mediante la implantación de microperlas que se remojan en una proteína o químicocal de interés dentro de un organismo, los investigadores pueden investigar los efectos localizados durante el desarrollo y encontrar asociaciones entre el gen o molécula de interés y en particular fenotipo biológico (s). Estudios como el realizado por la AMA y colegas utilizado implantación microperla con el fin de evaluar el efecto del aumento de la señalización de Hedgehog en el patrón esquelético en el neurocranium anterior (ANC) en el pez cebra 23. Estudios anteriores han demostrado que Shh es necesario para la formación de ANC 14. Uso de microperlas recubiertas con Shh investigadores identificaron que esta señal promueve la formación de cartílago en el ANC. Se utilizó el proceso de implantación microperla para demostrar un vínculo claro entre erizo de señalización y la formación de cartílago en el ANC. Otro ejemplo clave de esta técnica de manipulación de tejidos en el pez cebra se observa en los estudios donde los científicos investigaron el control transcripcional del eritroblastoma Veintiséis (ETS) de dominio fmolécula relacionada con ETS actores (ERM) y Polioma potenciador activador 3 (PEA3) por la señalización FGF durante principios de desarrollo del cerebro de pez cebra 19. A través de experimentos de implantación microesferas, que fueron capaces de demostrar que Fgf8 y Fgf3 pueden activar ectópica expresión de erm y PEA3. Estos ejemplos ilustran la utilidad de microperlas para proporcionar conocimientos sobre los mecanismos de desarrollo que colaboran durante la formación de tejido, que puede ser bien caracterizado por el uso de métodos para evaluar la expresión del gen 41. Por lo tanto, el trasplante de microperlas puede ser un método viable para explorar otros tejidos, tales como el mesodermo intermedio (IM) que da lugar al riñón. En concreto, se ayudaría a los estudios de desarrollo renal, para investigar cómo las diferentes moléculas afecta nefrona segmentación 42 y tubulogenesis 43,44, los procesos que se entienden sólo superficialmente en la actualidad. Además, la implantación de microperlas ha comenzado a ser utilizado al perno prisioneroprocesos de regeneración y en el pez cebra 29] y podrían ser adaptados para su uso con cualquier número de modelos de la regeneración de órganos, tales como después de la ablación con láser de tejidos embrionarios como la nefrona 45 o en conjunción con métodos que se han formulado para llevar a cabo la investigación con las estructuras adultas correspondientes 46-49. Finalmente, la implantación de microperlas tiene el potencial de ser utilizado en los modelos de enfermedades humanas, tales como el cáncer o tejido 50,51 52,53 degeneración. En el presente protocolo, se demuestra el método de implantación microperla en embriones de pez cebra, que también ha sido descrito de manera similar por otros investigadores, pero no se muestra a través de protocolos de video 1. Con la práctica mínima pudimos implantar microperlas a un ritmo aproximado de 8 a 10 embriones / h, que relaciona la viabilidad de este procedimiento una vez que el investigador tiene un poco de experiencia. Los resultados que se muestran en este documento demuestran que las perlas de diversos dimensiones se pueden implantar en las primeras etapas, y que con cuidado, esta técnica manipulación de los tejidos se pueden implementar con una interrupción física mínima para el embrión. Una mejora que se debe destacar es el uso de una herramienta whisker / pestañas para posicionar la microperla en el embrión. Esta pieza relativamente barato y simple de equipo es de aproximadamente el mismo diámetro que la microperla, es fácil de obtener y ayuda a acelerar el proceso de implantación. La barba / pestañas se puede cortar a una longitud deseada para producir una firma pero delicada herramienta de manipulación bead-, dependiendo de la destreza investigador y preferencia. Por último, mientras que describimos aquí cómo manipular físicamente microperlas y embriones de pez cebra para llevar a cabo la implantación, este protocolo no describe los procedimientos de manipulación específicas para diferentes fármacos o péptidos. En general, microperlas tratadas químicamente deben ser implantadas en el animal con la conveniencia, para evitar efectos no deseados en otras zonas del organismo, y los investigadores deben estar bien enformada por los posibles problemas de seguridad asociados con tales productos químicos antes de iniciar sus estudios. En resumen, hemos demostrado un método de implantación de microperlas relativamente simple y eficiente con una amplia gama de aplicaciones que utilizan materiales que están fácilmente disponibles en el laboratorio. En última instancia, esperamos que este manual ayudará a los investigadores a la naturaleza delicada de manipulación de los tejidos del pez cebra.

Investigadores de la biología del desarrollo utilizan una amplia gama de métodos celulares, moleculares y genéticos para descubrir los mecanismos que controlan cómo se forma un organismo. Entre estos enfoques, manipulación de los tejidos es una herramienta clave en el desciframiento de preguntas complejas sobre el destino celular, movimiento celular, y la organización de los tejidos. Una manera de alterar entornos tisulares locales es a través de la aplicación quirúrgica de microperlas que se utilizan para entregar una fuente focal de proteínas u otras moléculas de señalización 1. Este tipo de manipulación experimental ha sido ampliamente aplicado en modelos embriología vertebrados clásicos, como la rana y el polluelo 2. El pez cebra se ha convertido en un importante organismo modelo para el estudio de los vertebrados de organogénesis y también proporciona muchas ventajas únicas para el modelado de la enfermedad 3-5, ya que comparten alta conservación genética con los humanos 6. En particular, la transparencia óptica y exel desarrollo interno del embrión de pez cebra ofrece un punto de vista sin igual para la observación de la ontogenia tejido 3-5. La implementación de las pantallas adelante genéticos a gran escala ha generado un poderoso depósito de cepas mutantes de pez cebra para el estudio adicional 7,8, y la identificación de las técnicas de detección alternativos que pueden llevarse a cabo de manera eficiente a escala reducida en los laboratorios individuales 9,10. Más trabajo experimental con el pez cebra se ha facilitado gracias a los avances en las metodologías transgénicas y revertir enfoques genéticos 11,12, así como la genética química 13-15. Técnicas de manipulación de los tejidos, tales como la aplicación de microperlas, no han sido tan ampliamente empleado en el pez cebra, pero, no obstante, proporcionar una herramienta útil para comprender mejor la señalización celular durante el desarrollo. Implantación Microbead se ha utilizado para interrogar a los procesos de formación de órganos en la retina de pez cebra16,17, 18 de corazón, cerebro 19-22, cresta neural 23, y la aleta 24,25. En estos y otros estudios, los granos se han aplicado durante el desarrollo para entender la difusión de moléculas de señalización 26, cómo gradientes afectan la migración celular 27 y el patrón axial 28. Más recientemente, microperlas se han utilizado para evaluar los mecanismos de regeneración en adultos de pez cebra 29. En estudios de desarrollo, por ejemplo, el trabajo microperla pez cebra ha proporcionado una visión de los mecanismos de formación de las extremidades a través de estudios de la aleta pectoral 25. El brote aleta pectoral pez cebra es homóloga a la yema de la extremidad anterior en el ratón 30 y 31 del polluelo. El esbozo de la extremidad de los vertebrados tiene dos nodos esenciales de señalización: la zona de actividad polarizante (ZPA) que establece el eje antero-posterior a través de la expresión de Sonic hedgehog (Shh) y objetivos de genes Hox aguas abajo,y la cresta ectodérmica apical (AER) presente en la punta de la yema de la extremidad, que actúa para establecer proximal a la identidad de la extremidad distal a través de la expresión de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Mediante la implantación de microesferas de FGF empapadas en pez cebra mutantes genéticos Shh, investigadores FGF identificado como esencial para la progresión del ciclo celular y el crecimiento de la extremidad de vertebrados 25. Además de Fgf cascadas de señalización de Shh y que establecen la identidad posicional, estudios pioneros utilizando el primordio de la extremidad del polluelo identificado el ácido retinoico (RA) como una molécula que podría imitar la acción de la región de polarización para establecer la identidad anterior a posterior 32. Estos experimentos implicados colocando pequeñas tiras de papel Whatman empapado-RA en la extremidad de pollo para evaluar los patrones dígitos 32. Además, los investigadores han realizado otros estudios elegantes que emplean el uso de microperlas, el trasplante de células, y exógenoTratamientos con AR en el pez cebra para determinar que la AR actúa para proporcionar largo alcance señales posicionales en el cerebro posterior pez cebra y mesodermo 28. Sin embargo, en la actualidad quedan muchas preguntas acerca de los roles de factores como FGF y RA de señalización durante numerosos aspectos del desarrollo de los vertebrados. Los efectos de señalización de la AR, actuando como un morfógeno, afectan muchos órganos 33, como el corazón en desarrollo 34 y los progenitores renales, donde RA especifica células renales proximales tipo destinos 35-39. Una mayor comprensión de este tipo de temas podría beneficiarse significativamente de los estudios experimentales utilizando técnicas de manipulación de tejidos y de implantación microperla. Mientras que un menor número de estudios se han realizado con la implantación microperla en el pez cebra, en comparación con modelos como el pollo, las que se han llevado a cabo han sido muy informativo. Una razón de la escasez de la implantación microperla-investigación basada en el embrión de pez cebra es likely la noción de que hay desafíos técnicos difíciles, basado en el tamaño del embrión, que constituyen un impedimento para realizar con éxito tales manipulaciones. Sin embargo, la implantación de microperlas en embriones de pez cebra se puede aprender con la práctica y asistido través de la observación visual de la técnica, y por lo tanto puede llevarse a cabo como un medio para interrogar a los mecanismos de desarrollo. Aquí, demostramos la aplicación precisa de una microperla en el embrión de pez cebra, que puede ser utilizado para la realización de una amplia variedad de ensayos sobre la formación de tejido y la morfogénesis celular.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer Flask</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB-500-250</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-50B</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 Micropipette tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>2707402</td><td></td></tr><tr><td>Low Temperature Incubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Dimethly Sulfoxide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45-106 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>140-1454 AG1-X8</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45 &amp;micro;m)</td><td>Polysciences</td><td>7314</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Tweezer</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Needle</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tube holder</td><td>Globe Scientific Inc.&amp;nbsp;</td><td>51674</td><td></td></tr></tbody></table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

El pez cebra se ha convertido en un valioso sistema de modelo genético para el estudio de la biología del desarrollo y la enfermedad. El pez cebra comparten un alto grado de conservación genómica, así como similitudes en los procesos celulares, moleculares y fisiológicas, con otros vertebrados, incluyendo los seres humanos. Durante la ontogenia temprana, embriones de pez cebra son ópticamente transparente, permitiendo a los investigadores visualizar la dinámica de la organogénesis utilizando un sencillo microscopio estereoscópico. Implantación Microbead es un método que permite la manipulación de tejido a través de la alteración de los factores en entornos locales. Esto permite a los investigadores a ensayo los efectos de cualquier número de moléculas de señalización de interés, tales como péptidos secretados, en los puntos espaciales y temporales específicos dentro del embrión en desarrollo. Aquí, detallamos un protocolo de cómo manipular y cuentas de implantes durante el desarrollo del pez cebra temprano.

Varios tipos de herramientas de manipulación son útiles para el manejo de microperlas durante aplicaciones de investigación (Figura 1). Además, un molde de agarosa simple con pozos pequeños se puede utilizar para mantener el embrión de pez cebra, que es vital para llevar a cabo estos experimentos de manera oportuna y eficiente (Figura 1). La implantación de una microperla se puede realizar en la posición espacial y la etapa temporal de interés, lo que permite a los investigadores estrechen una ventana de acción específico para la molécula de interés. Aquí, microperlas individuales se implantaron en embriones de pez cebra en la etapa de cola brote o en posteriores puntos de tiempo durante las etapas somitogenesis (Figura 3). Dos microperlas de diferentes tamaños, se enjuaga con solución de Ringer solo, se utilizaron en este protocolo de demostración (Figura 3A, 3B y 3C). Esta implantación microbead en ausencia de cualquier conjugadopequeñas moléculas demuestra que la implantación de bolas puede lograrse sin efectos morfológicos brutos durante el desarrollo adecuado del embrión de pez cebra (Figura 4). El experimentador puede encontrar dificultades con la maniobra de la microperla en el orificio de punción realizada por una aguja de tungsteno encima del embrión. Para lograr un mejor manejo de la microperla una vez colocado en el embrión por el micro-aguja, a / herramienta de pestañas whisker se puede utilizar. Esto puede ser elaborado con arrojar naturalmente felino o canino bigotes, aunque otros filamentos pestañas naturales o sintéticos pueden ser utilizados (Figura 1). Un suave empujón del microperla, ya sea con la aguja de tungsteno o la herramienta de la barba debe ver la microperla hundirse en la solución de Ringer del molde. Una vez que el microbead se ha hundido en el molde que se debe mover grandes distancias si es necesario utilizando la aguja de tungsteno y una vez encima de la del embrión, la herramienta de la aguja o de la barba se puede utilizar para position la microperla en el embrión. El éxito de la implantación de microperlas se puede medir inmediatamente a través de la visualización en un microscopio estereoscópico, ya que el grano se mantendrá de forma estable posicionado en el tejido. Para evaluar la posición de talón con el tiempo, cada muestra embrión se pueden obtener imágenes a través de Live tiempo-curso de fotografía o comprueba a intervalos periódicos (tal como se representa en la Figura 4) para asegurar que la ubicación de talón no se ha desplazado durante la duración del experimento debido al tejido endógeno morfogénesis. La comprensión de la posición de la perla en el tiempo es crítico para la interpretación más informada de los resultados, tales como la evaluación del efecto de una molécula pequeña en un tejido diana o proceso de desarrollo. El uso de estos pasos anteriores proporcionará un entorno ideal para incrustar microperlas en el embrión de pez cebra a la vez y posición deseada. En nuestra experiencia, los usuarios novatos de este protocolo de implantación microperla normalmente ganaron el ne habilidadnece- para llevar a cabo la implantación quirúrgica consistente de microperlas en el embrión de pez cebra después de aproximadamente una semana de la práctica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> Figura 1. Herramientas utilizadas para llevar a cabo la implantación microperla. (A) La bandeja de la implantación de bolas (izquierda, 15 cm de diámetro) con moldes de embriones (a la izquierda) y una bandeja de incubación microperla (a la derecha, 6 cm de diámetro). Esta bandeja de trabajo permite al investigador para colocar los embriones en la orientación deseada para la implantación de microperlas, y para tener las microperlas preparados para la implantación en estrecha proximidad a la estación de microscopio. Microperlas deben incubarse en pequeña molécula (s) y / o vehículo y luego se enjuagaron en una placa separada de microperlas (derecha) antes de colocarlos en la bandeja de la implantación de bolas que se coloca debajo de la estación microscopio. (B) Dos pares de pinzas finas se utilizan para eliminar el Chorien torno a cada embrión de pez cebra y también para romper el extremo de la aguja microcapilar. Se empleará (C) Una aguja de tungsteno para hacer una punción muy fino en el embrión de pez cebra en el que para posicionar la microperla. (D) La pipeta de transferencia microcapilar será utilizado para recoger y colocar una microperla en la parte superior del embrión de pez cebra cerca del sitio de la punción. (E) La herramienta bigote / pestañas permitirá el posicionamiento suave de la microperla en el sitio de la incisión en el embrión que se hizo previamente por la aguja de tungsteno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> Figura 2. Representación esquemática del procedimiento de implantación de microperlas. (A) Una bandeja de implantación de microperlas con microperlas soaking en la solución de lavado deseado está configurado bajo un microscopio estereoscópico estación, y los embriones posicionada con el tejido hacia arriba. (B) Usando una aguja de tungsteno, de una pequeña incisión en el embrión se puede hacer con un ligero movimiento todavía contundente. (C) Con una pipeta de transferencia microcapilar, la microperla deseado puede ser recogido de la cámara de incubación microperla en la bandeja, situado a la derecha, y trajo al compartimento izquierdo donde el área de trabajo embrión se encuentra. El microbead debe ser depositado cerca del sitio de la incisión, a continuación, coloca suavemente en el sitio de la incisión hecha por la aguja de tungsteno utilizando el / herramienta de pestañas whisker. Una vez que una microperla es maniobrado en el sitio de la incisión, debe ser metido en el tejido (lejos de la incisión) en la posición de forma estable la microperla y evitar el movimiento subsiguiente de la embrión como el desarrollo continúa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>arrendar clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> Figura 3. microperlas pueden ser implantados en embriones en diferentes etapas de desarrollo. (A) embriones de pez cebra fueron implantados con una microperla (diámetro de aproximadamente 50 micras) en el tronco en la fase de brote de la cola. Cuando se examina en el implante poste de talón 24 hr (hpbi), los embriones habían desarrollado normalmente y la microperla mostró un mínimo movimiento durante el paso del tiempo de desarrollo. (B) los embriones de pez cebra implantados con microperlas (con un diámetro de aproximadamente 50 micras) en el saco de yema en la etapa 3 somite (ss) muestran un desarrollo normal con el movimiento del grano relativamente menor con el tiempo. (C) microperlas más grandes (diámetro de aproximadamente 70 micras) se implantaron en el embrión 7 ss de manera similar mostró posterior desarrollo normal, así como minimal si cualquier movimiento desde el lugar de implantación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> Figura 4. desarrollo bruto del embrión de pez cebra es perturbada por la presencia de una microperla a través de 72 hpbi. Embriones de pez cebra fueron implantados con microperlas empapados en solución de Ringer (con un diámetro de aproximadamente 50 micras) en la etapa 7 somite (ss). Cada microperla se inserta quirúrgicamente en el tronco, entre los somitas 3 y 4. La presencia de la cuenta no se asoció con defectos evidentes de desarrollo a 24 horas después del implante del grano (hpbi), 48 hpbi o 72 hpbi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo at JoVE.com

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.2K vistas.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Video: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biología

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Un dispositivo de trasplante simple y efectivo para embriones de pez cebra

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Biología del Desarrollo

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

Un modelo de embrión de pez cebra para In Vivo visualización y análisis Intravital de Biomaterial asociados Staphylococcus aureus infección

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Bioingeniería

<meta charset="utf8"></head><body>Elucidando el comportamiento de la microglía en el desarrollo del tectum óptico del pez cebra

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and function. Externally developing zebrafish embryos possess optical transparency, which along with well-characterized transgenic reporter lines that fluorescently label microglia, make zebrafish an ideal vertebrate model for such studies. In this paper, we take advantage of the unique features of the zebrafish model to visualize the dynamics of microglia cells in vivo and under physiological conditions. We use confocal microscopy to record a timelapse of microglia cells in the optic tectum of the zebrafish embryo and then, extract tracking data using the IMARIS 10.0 software to obtain the cells' migration path, mean speed, and distribution in the optic tectum at different developmental stages. This protocol can be a useful tool to elucidate the physiological significance of microglia behavior in various contexts, contributing to a deeper characterization of these highly motile cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Uso del pez cebra para explorar la migración de la microglía durante el desarrollo del cerebro

We demonstrate a method that takes advantage of fast scanning confocal microscopy to perform live imaging of microglia cells in the developing zebrafish optic tectum, allowing for the analysis of the dynamics of these cells in vivo.

Imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Un dispositivo de trasplante simple y efectivo para embriones de pez cebra

Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

Un modelo de embrión de pez cebra para In Vivo visualización y análisis Intravital de Biomaterial asociados Staphylococcus aureus infección

Imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra

Imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra

Imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra

Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad