Este protocolo será útil para los investigadores que quieran desarrollar métodos para la producción y purificación de AAV utilizando el sistema de cultivo celular baculovirus-insecto. La producción de AAV utilizando el sistema de cultivo celular baculovirus-insecto es un método rentable que es fácil de escalar y es compatible con las buenas prácticas de fabricación actuales. Algunas partes del protocolo serán demostradas por Alan Heizer, un asistente de investigación de mi laboratorio.
Comience descongelando un vial de células Sf9 e inmediatamente sembrarlas en 15 mililitros de medio de cultivo de células de insectos. Cultive células Sf9 en una incubadora de agitadores orbitales a 125 RPM y 28 grados Celsius en matraces de fondo redondo con una tapa suelta para el intercambio de aire. Propague las células en un matraz de un litro que contenga 200 mililitros de medio para obtener suficientes células para la producción de células TIPS.
Agregue 50 mililitros de celdas Sf9 a 2 veces 10 a las celdas de potencia 6 por mililitro en dos matraces. Infectar un matraz de células Sf9 con 0,5 mililitros de baculovirus-AAV2-GFP, y el otro matraz de células con 0,5 mililitros de baculovirus-AAV2-rep-cap. Tres días después, cosecha una pequeña alícuota de células Sf9 infectadas por baculovirus, también conocidas como células TIPS.
Tinción de 2 veces 10 a la 5ª potencia de células Sf9 no infectadas e infectadas por baculovirus con 0,5 microgramos de anticuerpo anti-baculovirus gp64 de ratón que contiene un colorante fluorescente en 100 microlitros de tampón de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de lavar las células con PBS para eliminar el anticuerpo, vuelva a suspender las células teñidas en 300 microlitros de PBS que contienen 0,5 albúmina sérica bovina. Analizar la expresión de baculovirus gp64 en células mediante citometría de flujo.
Cuando las células son 80 a 90% viables, con un aumento de diámetro, cosechar las células y criopreservar 1 veces 10 a la 7ª célula de potencia en un mililitro de medio de cultivo de insectos, suplantado con 10% de suero bovino fetal y 10% de sulfóxido de dimetilo en un recipiente de congelación lenta a 80 grados centígrados negativos. Al día siguiente, transfiera el tubo que contiene las células TIPS a un congelador de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Cultive y cultive células Sf9 naïve a 2 veces 10 a la 6ª célula de potencia por mililitro a 28 grados Celsius en varios matraces de dos litros que contienen 400 mililitros de medio de cultivo de células de insectos en una incubadora agitadora que se necesita para la producción de virus adenoasociados o AAV.
Después de tres o cuatro días, la densidad celular se incrementa hasta 5 a 6 veces 10 a la 6ª celda de potencia por mililitro. Para la producción de AAV en matraces en una incubadora de agitadores orbitales, use una pipeta o una bomba peristáltica para sembrar 400 mililitros de cultivo de Sf9 a 2 veces 10 a las 6ª celdas de potencia por mililitro en un matraz de dos litros, asépticamente. Configure el agitador orbital a 125 RPM y 28 grados centígrados.
Descongele un vial de cada célula TIPS de baculovirus-AAV-GFP y baculovirus-AAV-rep-cap. Diluya las células con 20 mililitros de medio de cultivo de insectos y realice un recuento de viabilidad de las células utilizando azul de tripano. Inocular ambas células TIPS en una proporción de 1 a 10.000 en relación con las células Sf9 ingenuas cultivadas en un matraz agitador o biorreactor.
En el segundo día, cosechar un mililitro de cultivo de Sf9 asépticamente y teñir con el tinte azul tripano para analizar el recuento de células, la viabilidad y la morfología. En el tercer día, repita los pasos realizados en el segundo día y verifique el estado de la infección por baculovirus después de teñir las células Sf9. En el quinto día, repita los pasos realizados en el segundo día y luego recolecte el medio de cultivo y las células cuando la viabilidad de Sf9 haya disminuido a alrededor del 50% Recoja el sobrenadante y el pellet celular después de girar, y guárdelos a 80 grados centígrados negativos.
Una vez que el pellet de célula productora de AAV se descongele, agréguele un tampón de lisis celular y mezcle vigorosamente. Incubar el pellet resuspendido durante 30 minutos a temperatura ambiente para liberar las partículas AAV. Después de la centrifugación, transfiera el lisado celular a un nuevo contenedor.
Mezcle el lisado celular y el sobrenadante de cultivo celular después de la descongelación. Agregue 20 unidades por mililitro de nucleasa y cloruro de magnesio 10 milimolar al lisado celular para digerir el ADN y el ARN, e incube durante dos a cuatro horas a 37 grados centígrados. Filtre el lisado a través de un sistema de doble filtración de polietersulfona de 0,8 micrómetros y 0,2 micrómetros utilizando una bomba.
Guarde el lisado celular clarificado a cuatro grados Centígrados durante la noche o purifique el AAV inmediatamente. Monte una columna AVB Sepharose de 10 mililitros en la máquina de cromatografía e inserte la tubería en la muestra AAV, el búfer de lavado y el tampón de elución. Inserte tubos en las ranuras del colector de fracciones de la máquina de cromatografía para recoger las fracciones de la solución de paso de columna, el tampón de lavado y el tampón de elución que contienen las partículas AAV.
Equilibre la columna AVB Sepharose con cinco volúmenes de columna de PBS a una velocidad de flujo de cinco mililitros por minuto. Cargue el lisado de celda filtrada que contiene partículas AAV en la columna de afinidad AVB Sepharose utilizando la máquina de cromatografía equipada con una bomba de muestras. Ejecute la muestra a un caudal de tres mililitros por minuto.
Pase PBS a través de la columna a una velocidad de flujo de tres mililitros por minuto hasta que la curva de absorbancia ultravioleta a 280 nanómetros regrese a la línea de base y se vuelva estable. Eluya las partículas AAV de la columna AVB Sepharose con tampón de citrato de sodio 50 milimolar pH 3 a una velocidad de flujo de tres mililitros por minuto. Diluya inmediatamente el sobrenadante AAV con un quinto de volumen de Tris HCl 8.0 de 500 milimolares para neutralizar el tampón de elución ácida que contiene AAV.
Esto evita la degradación mediada por pH que podría ocurrir con el tampón de elución de pH 3.0 ácido. Luego diluya el sobrenadante AAV diez veces con PBS, de modo que las partículas de AAV estén en un tampón fisiológico. Almacene un mililitro de cada columna de muestras de recorrido, tampón de lavado y 100 microlitros del sobrenadante AAV eluido para evaluar la presencia de AAV por infección de las células diana.
Configure el sistema de filtración de flujo tangencial, equipado con un cartucho de membrana de polietersulfona con un corte de peso molecular de 100 kilodalton para concentrar el AAV. Ejecute 200 mililitros de PBS durante 10 minutos para equilibrar el módulo de filtración de flujo tangencial. Cargue la muestra AAV controlando el flujo de la bomba hasta que la muestra se reduzca al volumen deseado.
Diafiltra el retentato con 100 mililitros de PBS. Después de concentrar la muestra de AAV en el volumen deseado, recoja la muestra de AAV, filtre a través de un filtro de polietersulfona de 0,2 micrómetros y alícuota. Luego almacene la muestra de AAV a 80 grados centígrados negativos.
La mayoría de las células Sf9 se infectaron con el baculovirus en tres o cuatro días, debido a las múltiples rondas de infección, evidenciadas por la expresión de la glicoproteína gp64 del baculovirus. La mayoría de las células también muestran un aumento en el diámetro. Las células muestran un aumento en el diámetro, el efecto citopático, y alrededor de la mitad de las células mueren en cinco días después de la infección, que son los signos de finalización de la producción de AAV.
Se observó un pico de proteína mientras se eluía con un tampón ácido correspondiente a la fracción AAV. Las muestras de AAV purificadas muestran tres proteínas de cápside distintas: VP1, VP2 y VP3, después de SDS-PAGE y tinción de plata. El paso más crítico es cosechar las células TIPS antes de la criopreservación, cuando la mayoría de las células se infectan con el baculovirus, con un número mínimo de muerte celular.
Hemos descrito la producción y purificación del vector AAV del serotipo 2 como modelo aquí. Sin embargo, el protocolo también se puede aplicar para otros serotipos AAV.
