سيكون هذا البروتوكول مفيدا للمحققين الذين يرغبون في تطوير طرق لإنتاج وتنقية AAV باستخدام نظام زراعة خلايا فيروس الحشرات الباكولو. إنتاج AAV باستخدام نظام زراعة خلايا فيروس الحشرات الباكولو هو طريقة فعالة من حيث التكلفة يسهل توسيع نطاقها وتتوافق مع ممارسة التصنيع الجيدة الحالية. بعض أجزاء البروتوكول سيبرهن عليها (آلان هايزر)، مساعد باحث في مختبري.
تبدأ عن طريق إذابة قارورة واحدة من خلايا Sf9 ، والبذور على الفور لهم في 15 ملليلتر من الخلايا الحشرية ثقافة المتوسطة. تنمو خلايا Sf9 في حاضنة شاكر المدارية في 125 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية في قوارير مستديرة القاع مع غطاء فضفاض المرفقة لتبادل الهواء. نشر الخلايا في قارورة لتر واحد تحتوي على 200 ملليلتر من المتوسطة للحصول على ما يكفي من الخلايا لإنتاج الخلايا TIPS.
أضف 50 ملليلتر من خلايا Sf9 بمعدل 2 × 10 إلى خلايا الطاقة السادسة لكل ملليلتر في قارورتين. تصيب قارورة واحدة من خلايا SF9 مع 0.5 ملليلتر من baculovirus-AAV2-GFP، وقارورة أخرى من الخلايا مع 0.5 ملليلتر من baculovirus-AAV2-rep-cap. بعد ثلاثة أيام، حصاد aliquot صغيرة من خلايا Sf9 المصابة بفيروس الكولو، والمعروف أيضا باسم خلايا TIPS.
وصمة عار 2 مرات 10 إلى السلطة 5 من كل من الخلايا SF9 غير المصابة وفيروس baculo مع 0.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة للفيروسات الكولوبولوس الماوس gp64 تحتوي على صبغة الفلورسنت في 100 ميكرولتر من العازلة حجب لمدة 30 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة في الظلام. بعد غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة، وإعادة تعليق الخلايا الملطخة في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5 ألبوم مصل البقري. تحليل التعبير gp64 فيروس baculo على الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي.
عندما تكون الخلايا قابلة للحياة بنسبة 80 إلى 90٪، مع زيادة في القطر، وحصاد الخلايا والتبريد 1 مرات 10 إلى خلايا الطاقة 7 في ملليلتر واحد من الحشرات ثقافة المتوسطة، لتحل محلها مع مصل البقر الجنين 10٪، و 10٪ ديميثيل سلفوإكسيد في حاوية بطيئة التجمد في 80 درجة مئوية سالبة. في اليوم التالي، نقل أنبوب يحتوي على خلايا TIPS إلى ثلاجة النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل. الثقافة وتنمو خلايا Sf9 السذاجة في 2 مرات 10 إلى خلية الطاقة 6 لكل ملليلتر في 28 درجة مئوية في عدة قوارير لترين تحتوي على 400 ملليلتر من الخلايا الحشرية ثقافة المتوسطة في حاضنة شاكر التي هي مطلوبة للفيروس المرتبطة أدينو أو إنتاج AAV.
بعد ثلاثة إلى أربعة أيام، يتم زيادة كثافة الخلية إلى ما يصل إلى 5 إلى 6 مرات 10 إلى خلايا الطاقة 6 لكل ملليلتر. لإنتاج AAV في قوارير في حاضنة شاكر المدارية، واستخدام ماصة أو مضخة معج للبذور 400 ملليلتر من ثقافة Sf9 في 2 مرات 10 إلى خلايا الطاقة 6 لكل ملليلتر في قارورة سعة لترين، بشكل مطهر. إعداد شاكر المدارية في 125 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية.
تذوب قارورة واحدة من كل خلايا BACULOVIRUS-AAV-GFP وbaculovirus-AAV-rep-cap TIPS. تمييع الخلايا مع 20 ملليلتر من الحشرات المتوسطة الثقافة، وإجراء عدد صلاحية الخلايا باستخدام تريبان الأزرق. تلقيح كل من الخلايا TIPS بنسبة 1 إلى 10،000 بالنسبة للخلايا Sf9 السذاجة المستزرعة في قارورة شاكر أو مفاعل حيوي.
في اليوم الثاني، حصاد ملليلتر واحد من ثقافة Sf9 بشكل مطهر، ووصمة عار مع صبغة زرقاء تريبان لتحليل عدد الخلايا، وقابلية البقاء، ومورفولوجيا. في اليوم الثالث، كرر الخطوات التي أجريت في اليوم الثاني، وتحقق من حالة عدوى فيروس الباكولو بعد تلطيخ خلايا SF9. في اليوم الخامس، كرر الخطوات التي أجريت في اليوم الثاني، ومن ثم حصاد ثقافة المتوسطة والخلايا عندما Sf9 البقاء قد انخفض إلى حوالي 50٪ جمع supernatant بيليه الخلية بعد الغزل، وتخزينها في 80 درجة مئوية سالبة.
بمجرد إذابة بيليه الخلية المنتجة لل AAV، أضف عازل تحلل الخلية إليها واخلطها بقوة. احتضان بيليه إعادة تعليق لمدة 30 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة للافراج عن جزيئات AAV. بعد الطرد المركزي، قم بنقل الخلية إلى حاوية جديدة.
خلط الخلية lysate والثقافة الخلية supernatant بعد ذوبان الجليد. إضافة 20 وحدة لكل نواة ملليلتر وكلوريد المغنيسيوم 10 ملليمولار إلى lysate الخلية لهضم الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، واحتضان لمدة ساعتين إلى أربع ساعات في 37 درجة مئوية. تصفية lysate من خلال 0.8 ميكرومتر و 0.2 ميكرومتر بولي إيثرسولفون نظام الترشيح المزدوج باستخدام مضخة.
تخزين lysate الخلية الموضحة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها، أو تنقية AAV على الفور. قم بتركيب عمود AVB Sepharose 10 ملليلتر على جهاز الكروماتوغرافيا، وأدخل خط الأنابيب في عينة AAV، وحاجز الغسيل، وحاجز elution. أدخل أنابيب في فتحات جمع الكسور في آلة الكروماتوغرافيا لجمع كسور من العمود تمرير من خلال الحل، وغسل العازلة، وحاجز elution التي تحتوي على جزيئات AAV.
يتوازن عمود AVB Sepharose مع خمسة أحجام عمود من PBS بمعدل تدفق قدره خمسة ملليلترات في الدقيقة. تحميل الخلية المصفاة lysate التي تحتوي على جزيئات AAV على عمود تقارب سيفاروز AVB باستخدام آلة الكروماتوغرافيا مجهزة مضخة عينة. تشغيل العينة بمعدل تدفق من ثلاثة ملليلترات في الدقيقة.
تشغيل برنامج تلفزيوني من خلال العمود بمعدل تدفق من ثلاثة ملليلتر في الدقيقة الواحدة حتى منحنى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر يعود إلى خط الأساس ويصبح مستقرا. Elute جزيئات AAV من العمود سيفاروز AVB مع 50 ملليمولار الصوديوم سيترات العازلة درجة الحموضة 3 بمعدل تدفق من ثلاثة ملليلتر في الدقيقة الواحدة. تمييع فورا AAV supernatant مع حجم خمس 500 ملليمولار تريس HCl pH 8.0 لتحييد العازلة elution الحمضية التي تحتوي على AAV.
وهذا يمنع تدهور بواقع الحموضة التي يمكن أن تحدث مع حموضة 3.0 elution العازلة. ثم تمييع TENNATANT AAV عشرة أضعاف مع برنامج تلفزيوني، بحيث جزيئات AAV هي في عازلة الفسيولوجية. تخزين ملليلتر واحد من كل عينة من خلال تشغيل العمود، وغسل العازلة، و 100 ميكرولتر من العملاق AAV eluted لتقييم وجود AAV عن طريق عدوى الخلايا المستهدفة.
قم بإعداد نظام ترشيح التدفق العرضي ، المجهز بخرطوشة غشاء البولي إيثرسلفون مع قطع الوزن الجزيئي 100 كيلودالتون لتركيز AAV. تشغيل 200 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لتوازن وحدة الترشيح تدفق عرضية. قم بتحميل عينة AAV عن طريق التحكم في تدفق المضخة حتى يتم تقليل العينة إلى الحجم المطلوب.
Diafiltrate إعادة مع 100 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. بعد تركيز عينة AAV على الحجم المطلوب ، قم بجمع عينة AAV ، وتصفية من خلال مرشح بولي إيثرسلفون 0.2 ميكرومتر ، وaliquot ذلك. ثم تخزين عينة AAV في 80 درجة مئوية سالبة.
أصبحت معظم خلايا Sf9 مصابة بفيروس الباكولو في ثلاثة إلى أربعة أيام ، بسبب جولات متعددة من العدوى ، يتضح من تعبير gp64 glycoprotein فيروس الكولو. معظم الخلايا تظهر أيضا زيادة في القطر. تظهر الخلايا زيادة في القطر ، وتأثير الخلايا ، ويموت حوالي نصف الخلايا في خمسة أيام بعد العدوى ، وهي علامات على الانتهاء من إنتاج AAV.
وشوهدت ذروة البروتين في حين elution مع عازلة الحمضية المقابلة لكسر AAV. تظهر عينات AAV المنقى ثلاثة بروتينات capsid متميزة: VP1 و VP2 و VP3 ، بعد SDS-PAGE وتلطيخ الفضة. الخطوة الأكثر أهمية هي حصاد خلايا TIPS قبل حفظ التبريد ، عندما تصاب معظم الخلايا بفيروس الباكولو ، مع الحد الأدنى من عدد وفيات الخلايا.
لقد وصفنا إنتاج وتنقية ناقل AAV من النمط المصلي 2 كنموذج هنا. ومع ذلك، يمكن تطبيق البروتوكول على الأنماط المصلية الأخرى AAV أيضا.
