이 프로토콜은 바쿨로바이러스-곤충 세포 배양 시스템을 이용하여 AAV 생산 및 정화 방법을 개발하려는 조사자들에게 유용할 것이다. 바쿨로바이러스-곤충 세포 배양 시스템을 이용한 AAV 생산은 확장이 용이하며 현재의 양호한 제조 관행과 호환되는 비용 효율적인 방법입니다. 프로토콜의 일부 부분은 앨런 Heizer에 의해 입증 될 것 이다, 내 실험실의 연구 조수.
Sf9 세포의 한 유리병을 해동하여 시작하여 곤충 세포 배양 배지의 15 밀리리터에 즉시 종자합니다. 125 RPM에서 궤도 셰이커 인큐베이터에서 Sf9 세포를 성장시키고, 공기 교환을 위해 느슨하게 부착 된 캡으로 둥근 바닥 플라스크에서 섭씨 28도성장하십시오. TIP 세포 생산을 위한 충분한 세포를 얻기 위하여 매체의 200 밀리리터를 포함하는 1 리터 플라스크에서 세포를 전파합니다.
2개의 플라스크에 밀리리터 당 6개의 전력 세포에 2회 10에 Sf9 세포의 50 밀리리터를 추가합니다. 바쿨로바이러스-AAV2-GFP의 0.5 밀리리터와 바쿨로바이러스-AAV2-rep-cap의 0.5 밀리리터를 가진 세포의 다른 플라스크를 가진 Sf9 세포의 1개의 플라스크를 감염시. 3 일 후, 바쿨로 바이러스 감염 Sf9 세포의 작은 알리쿼트수확, 또한 TIPS 세포로 알려진.
얼룩 2 회 10 에 감염 되지 않은 및 baculovirus 감염 Sf9 세포의 5 번째 힘 마우스 안티 baculovirus gp64 항체의 0.5 마이크로 그램을 포함 하는 100 마이크로 리터의 차단 버퍼의 100 마이크로 리터에 어두운 온도에서 30 분 동안 차단 버퍼. 항체를 제거하기 위해 PBS로 세포를 세척한 후, 0.5소 혈청 알부민을 함유한 PBS의 300마이크로리터에서 스테인드 세포를 다시 중단한다. 유동 세포측정법을 이용하여 세포에 대한 바쿨로바이러스 gp64 발현을 분석한다.
세포가 80~90%의 생존가능을 이루면, 직경이 증가하여, 10~7번째 전력세포에서 10배까지 10배의 세포와 저온보존을 곤충 배양 배지1밀리리터로 수확하고, 10%의 태아소 세럼과 10%디메틸 설프리옥스를 음의 80도에서 느린 동결 용기에 넣고 대체한다. 다음 날, TIPS 세포를 함유한 튜브를 액체 질소 냉동고로 옮겨 장기 보관합니다. 아데노 관련 바이러스 또는 AAV 생산에 필요한 셰이커 인큐베이터에서 곤충 세포 배양 배지 400 밀리리터를 함유한 여러 2리터 플라스크에서 밀리리터당 2배에서 6전력 세포까지 2배에서 6번째 전력 세포까지 2배에서 순진한 Sf9 세포를 배양하고 성장시키는 다.
3~4일 후, 세포 밀도는 밀리리터당 6번째 전력세포에 대해 10배까지 최대 5~6배까지 증가한다. 궤도 셰이커 인큐베이터에서 플라스크에서 AAV 생산을 위해 파이펫 또는 연막 펌프를 사용하여 2배 10~6번째 전력 셀을 2리터 플라스크로 2배 10시에 Sf9 배양 400밀리리터를 시드한다. 궤도 셰이커를 125 RPM과 섭씨 28도에서 설정합니다.
각 바큘로바이러스-AAV-GFP 및 바큘로바이러스-AAV-rep-cap TIPS 세포의 한 유리병을 해동. 곤충 배양 배지의 20 밀리리터로 세포를 희석하고, trypan blue를 사용하여 세포의 생존 수를 수행한다. 셰이커 플라스크 또는 바이오 반응기에서 배양된 순진한 Sf9 세포에 비해 팁 세포를 1 대 10, 000의 비율로 접종한다.
둘째 날, Sf9 배양의 1밀리리터를 무균적으로 수확하고, 트라이판 블루 염료로 얼룩을 수확하여 세포 수, 생존가능성 및 형태학을 분석한다. 셋째 날에는 2일째에 수행된 단계를 반복하고, Sf9 세포를 염색한 후 바쿨로바이러스 감염상태를 확인한다. 5일째에는 두 번째 날에 수행된 단계를 반복한 다음, Sf9 생존능력이 약 50%로 감소했을 때 배양 배지와 세포를 수확하여 회전 후 상체및 세포 펠릿을 수집하고 음의 80°C에 저장한다.
AAV 생산자 셀 펠릿이 해동되면 셀 리시스 버퍼를 추가하고 적극적으로 섞습니다. AAV 입자를 방출하기 위해 주변 온도에서 30 분 동안 다시 중단 된 펠릿을 배양합니다. 원심분리 후 셀 리세이트를 새 용기로 옮긴다.
해동 후 세포 리세이트와 세포 배양 상수체를 섞는다. 밀리리터 뉴클레아제당 20단위와 염화 마그네슘 10개를 세포 용해에 첨가하여 DNA와 RNA를 소화하고 섭씨 37도에서 2~4시간 동안 배양합니다. 펌프를 사용하여 0.8 마이크로미터 및 0.2 마이크로미터 polyethersulfone 이중 여과 시스템을 통해 용액을 필터링합니다.
정제된 셀 용해를 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하거나 AAV를 즉시 정화합니다. 10밀리리터 AVB 세파로즈 컬럼을 크로마토그래피 기계에 장착하고 파이프라인을 AAV 샘플에 삽입하고 버퍼 및 용출 버퍼를 삽입합니다. 크로마토그래피 기계의 분수 수집슬롯에 튜브를 삽입하여 AAV 입자를 포함하는 컬럼 통과 용액, 세척 버퍼 및 용출 버퍼의 분수를 수집합니다.
분당 5밀리리터의 유량으로 5개의 열 량의 PBS로 AVB 세파로즈 컬럼을 평형화합니다. AAV 입자를 함유한 여과된 셀 용하를 샘플 펌프가 장착된 크로마토그래피 기계를 사용하여 AV Sepharose 친화성 컬럼에 적재한다. 분당 3밀리리터의 유량으로 샘플을 실행합니다.
280나노미터의 자외선 흡광도 곡선이 기준선으로 돌아와 안정될 때까지 분당 3밀리리터의 유량으로 컬럼을 통해 PBS를 실행한다. 분당 3밀리리터의 유량으로 50밀리알나트륨 구연산 버퍼 pH 3로 AVB 세파로즈 컬럼의 AAV 입자를 엘테. AAV를 함유한 산성 용출 버퍼를 중화시키기 위해 500밀리머 트리스 HCl pH pH 8.0의 5분의 1 부피로 AAV 상체를 즉시 희석한다.
이렇게 하면 산성 pH 3.0 용출 버퍼로 발생할 수 있는 pH 매개 저하를 방지할 수 있습니다. 그런 다음 AAV 입자가 생리적 완충제에 있도록 PBS로 AAV 상피 10배를 희석시킵니다. 각 컬럼 런스루 샘플, 세척 버퍼 및 100 마이크로리터를 저장하여 대상 세포의 감염에 의한 AAV의 존재를 평가한다.
AAV를 농축하기 위해 100킬로달톤의 분자량 차단이 있는 폴레서술포네 멤브레인 카트리지를 장착한 접선 유동 여과 시스템을 설정합니다. 접선 흐름 여과 모듈을 상형화하기 위해 10분 동안 PBS 200 밀리리터를 실행합니다. 샘플이 원하는 부피로 감소될 때까지 펌프의 흐름을 제어하여 AAV 샘플을 로드합니다.
PBS의 100 밀리리터로 보행을 이질합니다. AAV 샘플을 원하는 부피에 농축한 후 AAV 샘플을 수집하고 0.2 마이크로미터 의 폴리테셔설폰 필터를 통해 필터링하고 알리쿼트합니다. 그런 다음 AAV 샘플을 음의 섭씨 80도에 저장합니다.
Sf9 세포의 대부분은 바쿨로바이러스 당단백질 gp64 발현에 의해 입증된 감염의 다중 라운드 때문에 3 4 일 안에 바쿨로바이러스에 감염되었다. 세포의 대부분은 또한 직경의 증가를 보여줍니다. 세포는 직경의 증가, 세포 병증 효과, 세포의 약 절반은 5 일 후에 감염 후에 정지한다는 것을 보여줍니다, 이는 AAV 생산의 완료의 표시입니다.
단백질의 피크는 AAV 분획에 대응하는 산성 완충제로 용출하는 동안 보였다. 정제된 AAV 샘플은 SDS-PAGE 및 은 염색 후 VP1, VP2 및 VP3의 세 가지 뚜렷한 캡시드 단백질을 보여줍니다. 가장 중요한 단계는 대부분의 세포가 세포 사멸의 최소 수와 함께 바쿨로 바이러스에 감염될 때 냉동 보존 전에 TIPS 세포를 수확하는 것입니다.
우리는 여기서 모델로 혈청형 2의 AAV 벡터의 생산 및 정제를 설명했다. 그러나 프로토콜은 다른 AAV 혈청형에도 적용될 수 있다.
