Este protocolo será útil para os pesquisadores que desejam desenvolver métodos para produção e purificação de AAV usando o sistema de cultura de células de insetos baculovírus. A produção de AAV usando o sistema de cultura de células de insetos baculovírus é um método econômico que é fácil de escalar e é compatível com a prática atual de boa fabricação. Algumas partes do protocolo serão demonstradas por Alan Heizer, um assistente de pesquisa do meu laboratório.
Comece descongelando um frasco de células Sf9, e imediatamente semeando-as em 15 mililitros de meio de cultura celular de insetos. Cresça células Sf9 em uma incubadora de shaker orbital a 125 RPM e 28 graus Celsius em frascos de fundo redondo com uma tampa frouxamente ligada para troca de ar. Prop propagar as células em um frasco de um litro contendo 200 mililitros de médio para obter células suficientes para a produção de células TIPS.
Adicione 50 mililitros de células Sf9 a 2 vezes 10 às células de 6ª potência por mililitro em dois frascos. Infecte um frasco de células Sf9 com 0,5 mililitros de baculovírus-AAV2-GFP, e o outro frasco de células com 0,5 mililitros de baculovírus-AAV2-rep-cap. Três dias depois, colhe uma pequena alíquota de células Sf9 infectadas pelo baculovírus, também conhecidas como células TIPS.
Colora 2 vezes 10 a 5ª potência de células Sf9 não infectadas e infectadas pelo baculovírus com 0,5 microgramas de anticorpo anti-baculovírus gp64 contendo um corante fluorescente em 100 microliters de tampão de bloqueio por 30 minutos a temperatura ambiente no escuro. Depois de lavar as células com PBS para remover o anticorpo, suspenda as células manchadas em 300 microliters de PBS contendo 0,5 albumina de soro bovino. Analise a expressão baculovírus gp64 em células usando citometria de fluxo.
Quando as células são 80 a 90% viáveis, com um aumento de diâmetro, colhem as células e criopreservam 1 vezes 10 a 7 células de potência em um mililitro de cultura de insetos médios, suplantados com soro bovino 10% fetal e 10% de sulfóxido de dimetil em um recipiente de congelamento lento a 80 graus negativos Celsius. No dia seguinte, transfira o tubo contendo células TIPS para um congelador de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Cultura e cultivar células Sf9 ingênuas a 2 vezes 10 a 6ª célula de potência por mililitro a 28 graus Celsius em vários frascos de dois litros contendo 400 mililitros de cultura celular de insetos em uma incubadora shaker que é necessária para o vírus associado ao adeno ou produção de AAV.
Após três a quatro dias, a densidade celular é aumentada para até 5 a 6 vezes 10 a 6ª células de potência por mililitro. Para a produção de AAV em frascos em uma incubadora de shaker orbital, use uma pipeta ou uma bomba peristáltica para semear 400 mililitros de cultura Sf9 em 2 vezes 10 a 6 células de potência por mililitro em um frasco de dois litros, asepticamente. Configure o agitador orbital a 125 RPM e 28 graus Celsius.
Descongele um frasco de cada células de pontas de baculovírus-AAV-GFP e baculovírus-AAV-rep-cap. Diluir as células com 20 mililitros de meio de cultura de insetos, e realizar uma contagem de viabilidade das células usando azul tripano. Inocular ambas as células TIPS a uma proporção de 1 a 10.000 em relação às células ingênuas Sf9 cultivadas em um frasco de shaker ou bio-reator.
No segundo dia, colher um mililitro da cultura Sf9 asepticamente, e manchar com o corante azul trypan para analisar a contagem celular, viabilidade e morfologia. No terceiro dia, repita as etapas realizadas no segundo dia e verifique o estado da infecção pelo baculovírus após a coloração das células Sf9. No quinto dia, repita os passos realizados no segundo dia e, em seguida, colher o meio de cultura e as células quando a viabilidade do Sf9 diminuiu para cerca de 50% Coletar o supernasce e a pelota celular após a fiação, e armazená-los a 80 graus Celsius negativos.
Uma vez que a pelota celular produtora de AAV seja descongelada, adicione o tampão de lise celular a ela e misture vigorosamente. Incubar a pelota re-suspensa por 30 minutos à temperatura ambiente para liberar as partículas AAV. Após a centrifugação, transfira a célula para um novo recipiente.
Misture o liseto celular e a cultura celular sobrenatante após o descongelamento. Adicione 20 unidades por nuclease mililitro e cloreto de magnésio de 10 mililitros ao lise celular para digerir o DNA e o RNA, e incubar por duas a quatro horas a 37 graus Celsius. Filtre o lysate através de um sistema de filtragem de poliésterulfone de 0,8 micrômetro e 0,2 micrômetros usando uma bomba.
Armazene o lise de células clarificadas a quatro graus Celsius durante a noite, ou purifique o AAV imediatamente. Monte uma coluna DE sepharose AVB de 10 mililitros na máquina de cromatografia e insira o pipeline na amostra AAV, tampão de lavagem e tampão de eluição. Insira tubos nas ranhuras coletoras de frações da máquina de cromatografia para coletar as frações da solução de passagem de coluna, tampão de lavagem e tampão de eluição contendo as partículas AAV.
Equilibre a coluna AVB Sepharose com cinco volumes de coluna de PBS a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto. Carregue o liseto celular filtrado contendo partículas AAV na coluna de afinidade AVB Sepharose usando o maquinário de cromatografia equipado com uma bomba de amostra. Execute a amostra a uma taxa de fluxo de três mililitros por minuto.
Execute o PBS através da coluna a uma taxa de fluxo de três mililitros por minuto até que a curva de absorção ultravioleta a 280 nanômetros retorne à linha de base e se torne estável. Elute as partículas AAV da coluna AVB Sepharose com 50 milimiliar de tampão de sódio pH 3 a uma taxa de fluxo de três mililitros por minuto. Diluir imediatamente o supernatante AAV com um volume de um quinto de 500 mililitros Tris HCl pH 8.0 para neutralizar o tampão de elução ácido contendo AAV.
Isso evita a degradação mediada por pH que pode ocorrer com o tampão de eluição ácida pH 3.0. Em seguida, diluir o supernatante AAV dez vezes com PBS, de modo que as partículas AAV estão em um buffer fisiológico. Armazene um mililitro de cada amostra run-through, tampão de lavagem e 100 microlitres do supernatante AAV elucido para avaliar a presença de AAV por infecção das células-alvo.
Configure o sistema de filtragem de fluxo tangencial, equipado com um cartucho de membrana polieethersulfone com um corte de peso molecular de 100 quilodalton para concentrar o AAV. Execute 200 mililitros de PBS por 10 minutos para equilibrar o módulo de filtragem de fluxo tangencial. Carregue a amostra AAV controlando o fluxo da bomba até que a amostra seja reduzida ao volume desejado.
Diafiltrar o retentato com 100 mililitros de PBS. Depois de concentrar a amostra AAV no volume desejado, colete a amostra AAV, filtre-a através de um filtro de polietroédfone de 0,2 micrômetro e aliquot-la. Em seguida, armazene a amostra de AAV a 80 graus Celsius negativos.
A maioria das células Sf9 foi infectada com o baculovírus em três a quatro dias, devido às múltiplas rodadas de infecção, evidenciadas pela expressão de baculovírus glicoproteína gp64. A maioria das células também mostram um aumento no diâmetro. As células mostram um aumento no diâmetro, efeito citopático, e cerca de metade das células morrem em cinco dias após a infecção, que são os sinais de conclusão da produção de AAV.
Um pico de proteína foi observado durante a elução com um tampão ácido correspondente à fração AAV. As amostras purificadas de AAV mostram três proteínas capsidas distintas:VP1, VP2 e VP3, após sarampo SDS-PAGE e silver staining. O passo mais crítico é a colheita das células TIPS antes da criopreservação, quando a maioria das células se infectam com o baculovírus, com um número mínimo de morte celular.
Descrevemos a produção e purificação do vetor AAV do sorotipo 2 como modelo aqui. No entanto, o protocolo também pode ser aplicado para outros sorotipos AAV.
